均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選朝鮮淫羊藿微波提取工藝的研究

姚慧敏，丁健秋

(通化師范學(xué)院 制藥與食品科學(xué)系，吉林 通化 134002)

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)、箭葉淫羊藿(EpimediumSagittatumMaxim)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)、巫山淫羊藿(Epimediumwushanense)和朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)干燥葉，又名仙靈脾，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品．《本草綱目》中稱其有“益精氣，堅(jiān)筋骨，補(bǔ)腰膝，強(qiáng)心力”等功效[1]．淫羊藿味辛甘、性溫，歸肝、腎經(jīng)，用于治療陽(yáng)痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣和更年期高血壓等疾病[2]．研究表明淫羊藿苷(Icariin)是其主要活性成分，它是一種8—異黃酮苷類化合物，具有增加心、腦血流量，雄激素樣作用，促進(jìn)骨代謝和免疫功能[3-4]，降血糖，抗衰老和抗腫瘤等功效[5]．本文研究建立了測(cè)定淫羊藿中淫羊藿苷含量的高效液相色譜法，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)方法優(yōu)化了淫羊藿的微波提取工藝，確定了淫羊藿苷的最佳提取條件，為淫羊藿藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)．

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀(四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè)器、Chemstation色譜工作站)，XH—200A電腦微波固液相合成/萃取儀(北京祥郜科技發(fā)展有限公司)，超聲波清洗器(必能信超聲有限公司)，朝鮮淫羊藿(采自吉林省集安市，經(jīng)過(guò)通化師范學(xué)院于俊林教授鑒定)，淫羊藿苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0737—9910，供含量測(cè)定用)．甲醇、乙腈均為色譜級(jí)，其他試劑均為分析純，水為純凈水．

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿苷含量測(cè)定方法的建立

(1)色譜條件.色譜柱：Agilent Ecilpse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm).流動(dòng)相：水-乙腈(74：26)；流速為1.0mL/min.檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm.柱溫：30℃．在此條件下，理論板數(shù)按淫羊藿苷計(jì)應(yīng)不低于2000．

(2)溶液的配制.供試品溶液的制備：取淫羊藿浸膏50mg，精密稱定，置25mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇至刻度，超聲處理30min后，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液1.0mL，置10mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻，即得．

對(duì)照品溶液的制備：取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加無(wú)水乙醇定量制成每1mL中分別含248μg的溶液，作為對(duì)照品貯備液．

(3)系統(tǒng)適用性.取供試品溶液，進(jìn)樣，依法測(cè)定，記錄色譜圖，淫羊藿苷理論塔板數(shù)分別為3，7，0，4，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合要求．

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.分別精密吸取貯備液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL至10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇至刻度，分別制成系列濃度溶液，搖勻，精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，淫羊藿苷在4.96～49.6μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：C=0.0283A+0.2766(r=0.9999)．

(5)進(jìn)樣精密度試驗(yàn).取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷濃度均為24.5μg/min的供試品溶液，日內(nèi)和日間反復(fù)注入液相色譜儀，記錄色譜圖的峰面積，日間RSD為0.43%，日內(nèi)RSD為0.27%，結(jié)果表明本品的日內(nèi)、日間精密度良好．

(6)穩(wěn)定性試驗(yàn).取淫羊藿苷濃度24.5μg/min的供試品溶液，分別于0，1，3，6，12h，注入液相色譜儀，記錄色譜圖的峰面積，RSD為0.32%，結(jié)果表明溶液放置12h穩(wěn)定．

(7)重復(fù)性試驗(yàn).取淫羊藿提取物，按供試品溶液制備方法制備并測(cè)定，記錄色譜圖的峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量，RSD為0.58%．

(8)回收率試驗(yàn).精密稱取已知含量的淫羊藿提取物50mg(含淫羊藿苷120.5mg/g)，共6份，精密加入等量的淫羊藿苷對(duì)照品，按含量測(cè)定項(xiàng)下稀釋，分別進(jìn)樣3次，記錄色譜圖，將峰面積帶入線性回歸方程，計(jì)算測(cè)定結(jié)果，淫羊藿苷的平均加樣回收率為99.7%，RSD=0.38%．

(9)樣品測(cè)定.取淫羊藿浸膏50mg，精密稱定，按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量．三批供試品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1．

表1 朝鮮淫羊藿浸膏中淫羊藿苷含量測(cè)定結(jié)果表

2.2 淫羊藿提取方法及優(yōu)化

(1)單因素考察.為了考察微波功率、提取時(shí)間、固液比、乙醇濃度等因素對(duì)超聲波提取淫羊藿苷的影響，進(jìn)行了單因素的試驗(yàn)考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響淫羊藿苷提取率的主要因素為超聲功率、提取時(shí)間和溶劑倍數(shù)．經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定提取溶劑為80%乙醇，3個(gè)主要因素的取值范圍：超聲功率為350～600W，超聲提取時(shí)間為10～35min，溶劑倍數(shù)為5～10倍．

(2)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選表.將超聲功率、提取時(shí)間和溶劑倍數(shù)確定為3個(gè)因素，每個(gè)因素等分為6個(gè)水平，按照確定的因素和水平數(shù)，選擇均勻設(shè)計(jì)表中U6﹡(64)使用表的1、2、3列．具體試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2．

(3)均勻設(shè)計(jì)結(jié)果.使用Version2.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行逐步回歸處理，得到回歸方程Y=1.269+0.00947X1+0.00426X2+0.000518X3，其中Y為淫羊藿苷含量、X1為超聲提取時(shí)間、X2為固液比、X3為乙醇濃度．方差分析結(jié)果詳見(jiàn)表3，由表3可知，復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.9935，F(xiàn)=90.35，表明該回歸方程在α=0.05水平上有顯著意義．由于各自變量的變化范圍不同，因而不能直接用偏回歸系數(shù)數(shù)值的大小來(lái)說(shuō)明各變量的重要性，為此要運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)化偏回歸系數(shù)(standardpartialregressioncoefficient)．將回歸方程偏回歸系數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理得標(biāo)準(zhǔn)化偏回歸系數(shù)(Bi)，B1=0.8917，B2=0.8503，B3=0.0561．分析標(biāo)準(zhǔn)化偏回歸系數(shù)及方程可知，影響超聲提取的因素依次為超聲功率、提取時(shí)間和溶劑倍數(shù)．對(duì)數(shù)據(jù)處理軟件獲得的回歸方程進(jìn)行自動(dòng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化程序處理，并結(jié)合實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，選擇淫羊藿苷的最佳超聲提取條件為：超聲功率400W，提取時(shí)間為20min，溶劑倍數(shù)為8倍．

表2 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果表(n=3)

表3 方差分析結(jié)果表

(4)優(yōu)選工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).根據(jù)優(yōu)化工藝進(jìn)行淫羊藿苷的提取，精密稱取淫羊藿100.0g，制備3批樣品，按“2.1中(9)”項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)得淫羊藿苷的轉(zhuǎn)移率為94%，RSD為0.38%，表明優(yōu)選工藝提取朝鮮淫羊藿中淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率高，重現(xiàn)性好．

3 討論

(1)本實(shí)驗(yàn)確定3個(gè)因素，每一因素設(shè)計(jì)了6個(gè)水平，共6次試驗(yàn)進(jìn)行研究，完成了淫羊藿中淫羊藿苷的提取工藝優(yōu)化．若采用正交設(shè)計(jì)，則至少要做63=216次試驗(yàn)．為減少試驗(yàn)次數(shù)，故本實(shí)驗(yàn)采用了均勻設(shè)計(jì)法．均勻設(shè)計(jì)是我國(guó)數(shù)學(xué)家方開(kāi)泰創(chuàng)立的一種多因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，由于拋開(kāi)了正交設(shè)計(jì)中的“整齊可比性”而只考慮試驗(yàn)點(diǎn)的“均勻分散性”，那些在正交設(shè)計(jì)中為整齊可比而設(shè)置的試驗(yàn)點(diǎn)可以不再考慮，因而用均勻設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)可大大減少試驗(yàn)次數(shù)[6，7].

(2)淫羊藿的主要有效成分為苷類，此類成分易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑[8]，故常采用水、乙醇等溶劑進(jìn)行提?。运疄槿苊竭M(jìn)行提取時(shí)，濃縮時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，有效成分破壞大，以乙醇為溶媒提取時(shí)，雜質(zhì)成分多，尤其是含葉綠素多，所以本實(shí)驗(yàn)選用水—乙醇混合溶媒為提取淫羊藿苷的溶劑．

(3)分別考察了甲醇—水等各種比例作為流動(dòng)相洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷峰型差．因此，采用不同比例的乙腈—水作為流動(dòng)相洗脫，當(dāng)乙腈—水的比例為26:74時(shí)，淫羊藿苷的出峰時(shí)間適中，基線平穩(wěn)，峰形較好且與其他組分能夠完全分離．

(4)通過(guò)考察微波功率、提取時(shí)間和溶劑倍數(shù)3個(gè)因素對(duì)淫羊藿苷提取轉(zhuǎn)移率的影響，經(jīng)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化分析后，確定了淫羊藿超聲提取最佳工藝：超聲功率400W，提取時(shí)間為20min，溶劑倍數(shù)為8倍，根據(jù)優(yōu)化工藝進(jìn)行淫羊藿苷的提取，淫羊藿苷的轉(zhuǎn)移率為94%，表明優(yōu)選工藝提取朝鮮淫羊藿中淫羊藿苷轉(zhuǎn)移率高，重現(xiàn)性好．

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