年齡和組織類型對(duì)X連鎖Alport綜合征女性患者X染色體失活方式的影響

張宏文 王 芳 丁 潔

Alport綜合征(AS)是最常見的遺傳性腎臟疾病，臨床主要表現(xiàn)為血尿和進(jìn)行性腎功能減退，常伴感音神經(jīng)性耳聾和眼部病變等。AS具遺傳異質(zhì)性，X連鎖顯性遺傳是其主要遺傳方式，由COL4A5和(或)COL4A6基因突變所致[1,2]。X連鎖AS(XLAS)男性患者臨床癥狀較重，常進(jìn)展至終末期腎病(ESRD)，而XLAS女性患者臨床表現(xiàn)差異較大，從無癥狀血尿到慢性腎功能衰竭均可發(fā)生。已知XLAS女性患者臨床表型的較大差異不能單純用COL4A5基因突變來解釋，特別是來自同一家系基因型完全相同的姐妹，臨床表型可以截然不同，提示除了COL4A5基因突變外可能還有其他因素影響臨床表型[3,4]。

研究表明其他X連鎖遺傳性疾病臨床表型的差異和X染色體失活有關(guān)[5,6]，因此推測(cè)XLAS女性患者的臨床表型差異可能也與X染色體失活相關(guān)[3,7,8]，但與其他X連鎖遺傳性疾病相似，目前有關(guān)X染色體失活與XLAS女性患者臨床表型關(guān)系的研究結(jié)果相互矛盾或不一致，尚無定論[9～14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，X染色體失活存在年齡和組織特異性[15～17]，這也許能解釋為什么有關(guān)X連鎖遺傳性疾病和X染色體失活研究的結(jié)果互相矛盾。為此，本研究觀察了不同年齡和組織類型對(duì)XLAS女性患者X染色體失活方式的可能影響，以期解釋臨床上有關(guān)XLAS女性患者與X染色體失活相互關(guān)系研究結(jié)果不一致的主要原因。

1 方法

1.1 XLAS的診斷標(biāo)準(zhǔn) XLAS的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Flinter等[18,19]的4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：①血尿或慢性腎功能衰竭家族史；②腎活檢電鏡檢查有典型病變；③進(jìn)行性感音神經(jīng)性耳聾；④眼部病變。符合以上3/4項(xiàng)即診斷為XLAS。并結(jié)合腎小球基底膜(GBM)Ⅳ膠原α3、α4 和α5鏈的染色和皮膚基底膜(EBM)Ⅳ膠原α5鏈的染色及COL4A5基因突變分析結(jié)果[18,19]。

1.2 研究家系的納入標(biāo)準(zhǔn) 1997年1月至2006年12月北京大學(xué)第一醫(yī)院(我院)兒科腎臟病遺傳門診就診、符合XLAS診斷標(biāo)準(zhǔn)的家系。

1.3 研究家系的排除標(biāo)準(zhǔn) ①家系病例資料不完整；②就診時(shí)家系中沒有男性患者或已死亡，就診時(shí)家系中沒有女性患者或已死亡；③不能獲得外周血或皮膚成纖維標(biāo)本。

1.4 分組 已知根據(jù)家系中男性發(fā)生ESRD的年齡將AS家系分為青少年型(31歲前發(fā)生)和成年型(31歲以后發(fā)生)[20]。本研究中多數(shù)家系不能確定其為青少年型或成人型，為方便分析以30歲為年齡界點(diǎn)，將XLAS家系中女性患者分為兩組，年齡≤30歲為A組，年齡>30歲為B組。

1.5 倫理和知情同意 本研究通過我院倫理委員會(huì)審批，家系中的每例患者均簽署知情同意書，包括同意采集外周靜脈血、皮膚活檢、COL4A5基因突變分析和X染色體失活分析。未成年患兒由家長(zhǎng)代為簽署。

1.6 DNA提取 簽署知情同意書后的任意時(shí)間點(diǎn)采集患者及其家屬靜脈血3 mL，鹽析法提取淋巴細(xì)胞基因組DNA。對(duì)家系中的女性患者在前臂下1/3處進(jìn)行皮膚活檢，皮膚活檢和皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)[18]，同時(shí)采用試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)提取皮膚成纖維細(xì)胞DNA，按說明書操作。

1.7 X染色體失活分析 通過PCR擴(kuò)增雄性激素受體(AR)基因第一外顯子CAG重復(fù)序列的多肽性分析X染色體失活，方法參見 Allen等[21]的報(bào)道，根據(jù)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行稍加調(diào)整。X染色體失活比例計(jì)算公式[17]：

失活率=(d1/u1)/(d1/u1+d2/u2)×100%

其中 d1和d2分別代表消化樣本PCR產(chǎn)物2條帶峰值大小，u1和u2則分別代表未消化樣本PCR產(chǎn)物2條帶峰值大小。以X染色體失活率≥80%作為X染色體失活傾斜的標(biāo)準(zhǔn)[22,23]。每個(gè)家系同時(shí)分析1例男性患者，以區(qū)分突變COL4A5等位基因所在X染色體[14]。每一標(biāo)本X染色體失活分析均檢測(cè)2次，取其平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。

本課題組以X染色體失活率50%為臨界點(diǎn)，以兩種組織中同一條X染色體失活比例同時(shí)>或<50%，認(rèn)為兩種組織中以同一條X染色體失活為主；以兩種組織中同一條X染色體失活比例一種>50%和一種<50%，認(rèn)為兩種組織分別以兩條X染色體中的一條失活為主。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同組間X染色體失活率比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間我院兒科腎臟病遺傳門診共診斷XLAS家系186個(gè)，符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的XLAS家系共32個(gè)，包括36例女性患者和32例男性患者。A組13例，B組23例，平均年齡分別為(17.9±11.7)和(38.6±6.2)歲。XLAS家系的納入和排除流程見圖1。

圖1 研究對(duì)象的納入和排除流程

Fig 1 Flow chart of patients selection process

2.2 年齡對(duì)X染色體失活的影響 36例女性患者中，外周血中AR基因位點(diǎn)雜合者32例，異質(zhì)性為88.9%(32/36例)；AR基因位點(diǎn)純合者4例，其中A組1例，B組3例。以80%作為X染色體失活傾斜的標(biāo)準(zhǔn)[22,23]，外周血中X染色體失活傾斜率為12.5%(4/32例)，其中A組0例，B組4/20例(20.0%)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.743，P=0.098)；以70%作為X染色體失活傾斜的標(biāo)準(zhǔn)，外周血中X染色體失活傾斜率為28.1%，其中A組4/12例(33.3%)，B組5/20例(25.0%)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.258，P=0.612)。

2.3 組織類型對(duì)X染色體失活的影響 12例女性患者同時(shí)分析外周血和皮膚成纖維細(xì)胞X染色體失活。如表1所示，兩種組織中X染色體失活方式明顯不同，3例(例1,6,10)患者僅皮膚成纖維細(xì)胞顯示為X染色體失活傾斜而外周血無失活傾斜；1例(例3)外周血中顯示X染色體失活傾斜而皮膚成纖維細(xì)胞無失活傾斜。7/12例(58.3%)患者兩種組織中以同一條X染色體失活為主；5/12例(41.7%)患者則相反，即外周血中以兩條X染色體中的一條失活為主，皮膚成纖維細(xì)胞中則以另一條失活為主，差別最高達(dá)43.5%。

表1 12例XLAS女性患者外周血和皮膚成纖維細(xì)胞X染色體失活情況

Tab 1 X-inactivation patterns of 12 XLAS females in peripheral blood cells and skin fibroblasts

Casenum?berAge/yearsX?inactivationrateofthemutantallele/%PeripheralbloodcellsSkinfibroblasts12973．680．92473．574．133420．054．544865．755．953133．434．363752．282．673655．838．884134．943．493221．768．910453．19．6113446．021．5123668．439．5

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36例XLAS女性患者中，4例AR基因位點(diǎn)為純合，即兩條X染色體上AR基因的CAG 重復(fù)數(shù)目相等，因此不能用PCR擴(kuò)增AR基因第一外顯子CAG重復(fù)序列多肽性的方法分析其X染色體失活情況。因此，本研究AR基因的雜合度為88.9%(32/36例)，與其他研究者的報(bào)道相似(86.5%～90.0%)[17,24]。以80%作為X染色體失活傾斜的標(biāo)準(zhǔn)，外周血中X染色體失活傾斜率為12.5%(4/32例)，與其他研究者結(jié)果一致[17]。

雖然部分研究顯示大年齡組外周血或口腔黏膜細(xì)胞中的X染色體失活傾斜率高于小年齡組[25～27]，但更多研究顯示年齡與X染色體失活傾斜率兩者間無相關(guān)性，而與遺傳因素有關(guān)[28,29]。Sandovici等[30]對(duì)178名正常女性兩份不同時(shí)間(相隔20年以上)的外周血標(biāo)本進(jìn)行了X染色體失活分析，未發(fā)現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)X染色體失活傾斜率增加。由于是同一個(gè)體不同時(shí)間的X染色體失活情況的自身對(duì)比，所以該研究的結(jié)果相對(duì)較為準(zhǔn)確可靠。Amos-Landgraf等[31]檢測(cè)了1 005名正常女性外周血中X染色體失活情況，結(jié)果顯示成年女性X染色體失活傾斜率高于新生兒，但在成年女性之間并無差異，即隨年齡增長(zhǎng)X染色體失活傾斜比例增加并不明顯。本研究結(jié)果顯示，無論是以80%或70%作為X染色體失活傾斜的標(biāo)準(zhǔn)，A組和B組外周血X染色體失活傾斜率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與上述多數(shù)研究者的結(jié)果相似，即年齡對(duì)X染色體失活無明顯影響。

同時(shí)有研究表明同一個(gè)體X染色體失活存在組織差異性[16,17]，即同一個(gè)體外周血、皮膚、口腔黏膜和尿道上皮細(xì)胞等組織中X染色體失活比例明顯不同。Gale等[32]分析了20例不同胃腸道疾病女性患者外周血、皮膚和肌肉組織的X染色體失活情況，結(jié)果顯示11/20例(55.0%)患者3種組織中X染色體失活比例相似，9/20例(45.0%)患者兩種或3種組織間X染色體失活比例明顯不同，差別最高達(dá)50%以上。本研究中12例女性患者同時(shí)分析了外周血和皮膚成纖維細(xì)胞中X染色體失活情況，兩種組織中X染色體失活方式明顯不同，3例患者僅皮膚成纖維細(xì)胞顯示為X染色體失活傾斜而外周血無失活傾斜；1例患者外周血中顯示X染色體失活傾斜而皮膚成纖維細(xì)胞無失活傾斜。7/12例(58.3%)患者兩種組織中以同一條X染色體失活為主；5/12例(41.7%)患者則相反，差別最高達(dá)43.5%，與Gale等[32]的結(jié)果相似。此外，Azofeifa等[16]研究外周血、肌肉和甲狀腺組織間X染色體失活情況，Sharp等[17]對(duì)外周血、口腔黏膜細(xì)胞和尿道上皮細(xì)胞組織間X染色體失活情況進(jìn)行了研究，結(jié)果均證實(shí)X染色體失活存在組織特異性。

根據(jù)目前有關(guān)X染色體失活與XLAS女性患者臨床表型的研究結(jié)果，似乎尚不能完全以X染色體失活來解釋XLAS女性患者臨床表型的差異性。首先，因同一個(gè)體的X染色體失活方式相對(duì)衡定，不隨年齡增長(zhǎng)而明顯變化，而已知XLAS女性患者的臨床表現(xiàn)，如蛋白尿或腎功能不全呈動(dòng)態(tài)變化，即隨年齡增長(zhǎng)而加重，兩者不平行。其次，假設(shè)X染色體失活確實(shí)與XLAS女性患者的臨床表型相關(guān)，那么該采用何種臨床指標(biāo)和哪部分組織進(jìn)行分析？目前尚無定論，仍需更多的研究進(jìn)一步分析。另外，除了年齡和組織類型對(duì)X染色體失活方式的影響，不同研究者采用的不同研究方法以及樣本量太小等也可能影響結(jié)果的一致性[14,33]，因此需要增加樣本量并采用相同檢測(cè)方法來進(jìn)一步評(píng)價(jià)或證實(shí)兩者間的真實(shí)關(guān)系。另外，其他的表觀遺傳學(xué)因素如DNA甲基化、組蛋白乙酰化和非編碼RNAs修飾等均可能對(duì)X染色體失活方式產(chǎn)生影響[34,35]。

本研究結(jié)果證實(shí)，不同組織類型而非年齡可能影響XLAS女性患者的X染色體失活方式，這也許是臨床上有關(guān)XLAS女性患者和X染色體失活相互關(guān)系研究結(jié)果不一致的一個(gè)主要原因，因此有關(guān)X染色體失活對(duì)XLAS女性患者臨床表型差異的影響尚需進(jìn)一步研究。

本研究的不足之處和局限性：①本研究?jī)H比較了外周血和皮膚組織的X染色體失活方式，在后續(xù)的研究中需要增加組織樣本種類，特別是腎臟組織，以評(píng)價(jià)不同組織類型對(duì)XLAS女性患者X染色體失活方式的影響；②本研究中大多數(shù)患者年齡在40歲以下，因此需要進(jìn)一步長(zhǎng)期隨訪以判定年齡對(duì)XLAS女性患者X染色體失活的影響；③本研究樣本量較小，且未考慮其他表觀遺傳學(xué)因素，后續(xù)研究需要增加樣本量進(jìn)一步研究。

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