54株分枝桿菌國際參考株16S rRNA序列分析

閆李俠，黃至澄，徐黔寧，陳保文，王國治

(1、臺州市第一人民醫(yī)院，浙江臺州 318020；2、中國藥品生物制品檢定所 100050)

54株分枝桿菌國際參考株16S rRNA序列分析

閆李俠1，黃至澄1，徐黔寧1，陳保文2，王國治2

(1、臺州市第一人民醫(yī)院，浙江臺州 318020；2、中國藥品生物制品檢定所 100050)

目的分析54株分枝桿菌國際參考株16S rRNA序列，為臨床分離株的鑒定提供參考。方法用16S rRNA序列分析法對54株分枝桿菌國際參考株進行分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，計算相似性百分比。結果除11株(共9種4組)分枝桿菌，即產(chǎn)鼻疽分枝桿菌與塞內加爾分枝桿菌；潰瘍分枝桿菌與海分枝桿菌；堪薩斯與胃分枝桿菌；3株結核分枝桿菌與田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌16S rRNA基因序列完全相同無法相互鑒別，其它41株(共41種)分枝桿菌菌種間16S rRNA均不相同可以得到很好的鑒別。結論16S rRNA基因序列分析是一種很好的鑒定分枝桿菌的方法，國際參考株16S rRNA基因序列的研究彌補了基因數(shù)據(jù)庫的不足。

分枝桿菌；16S rRNA；序列分析

rRNA基因被稱為細菌的“活化石”，是目前細菌系統(tǒng)發(fā)育分類與鑒定的最常用靶基因。rRNA基因存在染色體上，包括長約1.6kb的16S，3.3kb的23S，0.12kb的5S基因。由于16S rRNA基因的長度適中，并且高變區(qū)序列具有細菌屬、種的特征，因而16S rRNA基因的序列測定已作為細菌分類和鑒定的“金標準”[1]。但16S rRNA基因序列分析定要想成為一種臨床檢測的常規(guī)方法，還需要一個強大的質控序列數(shù)據(jù)庫[2，3]；而目前的數(shù)據(jù)庫還不夠完善，甚至數(shù)據(jù)庫的有些信息是錯誤的[4]，這在一定程度上限制了分子鑒定技術的臨床應用性。分枝桿菌國際參考株為國內外分枝桿菌研究的標準對照株，起實驗質量控制作用。但到目前為止尚無54株國際參考株16S rRNA基因的系統(tǒng)研究報道。本研究的目的在于分析54株國際參考株16S rRNA基因序列以補充基因庫中尚未公布的部分分枝桿菌基因，為實現(xiàn)16S rRNA基因分析方法的常規(guī)性提供了重要的基礎條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株：實驗所用國際參考菌株54株均由ATCC引進并在中國醫(yī)學細菌保藏管理中心保藏。

1.1.2 PCR引物和測序引物：上游引物(位于分枝桿菌 16Sr RNA 基因的 62～85 位核苷酸)：5′-CAC ATG CAA GTC GAA CGG AAA GG-3′下游引物(位于分枝桿菌 16S rRNA 基因 626～647位核苷酸)：5′-GCC CGT ATC GCC CGC ACG CT-3′。上下游引物擴增16S rRNA基因5′端～585bp片段，測序引物與擴增引物相同。引物均由上海英俊生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備 將實驗菌株接種于改良羅氏培養(yǎng)基斜面上，慢生長分枝桿菌37℃或28℃培養(yǎng)2～3周，快生長分枝桿菌培養(yǎng)5～7d。將培養(yǎng)物混懸于1ml 0.9%生理鹽水中，12000r/min離心5min棄上清，加入 200μl TE 緩沖液，100℃煮沸 15min，12000 r/min4℃離心20min，取含有DNA的上清液置于另一滅菌EP管中于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 在50μl反應體系內PCR擴增，10×PCR buffer 5μl，上游引物和下游引物終濃度各0.2μmol/L，4 ×dNTP 終 濃 度 各 為 0.2mmol/L，rTaq DNA聚合酶2U，DNA模板10～15ng，加雙蒸水至50μl。94℃預變性 5min，擴增條件 94℃ 1min，64℃1 min，72℃ 1min，共 30 個循環(huán)，72℃延伸 7min。

1.2.3 DNA純化與測序 使用Takara公司生產(chǎn)的DV805A純化試劑盒回收純化目的DNA、所有DNA樣品送上海生工生物工程公司做上、下游測序并將雙向結果拼接后得到最準確序列。

1.2.4 核苷酸序列分析 對所測定序列用Clustalx 1.83軟件進行同源性多序列比對，并用鄰位相連法(Neighbour Joining,N-J法)繪制16S rRNA基因序列聚類分析樹狀譜，使用DNAStar的MegAlign軟件計算相似性百分比。

2 結果

2.1 54株分枝桿菌參考株16S rRNA基因PCR擴增：成功完成54株分枝桿菌的16S rRNA基因PCR擴增，均得到一約585bp的16S rRNA 5′端DNA片段，與目的條帶大小相符，見圖1。

圖1 分枝桿菌16S rRNA基因5′端PCR擴增結果

圖2 分枝桿菌參考株16S rRNA基因5′端DNA多序列比對

圖3 依據(jù)分枝桿菌標準株16S rRNA基因構建的聚類分析樹狀譜

圖4 54株分枝桿菌參考株之間的相似性百分比

2.2 54株分枝桿菌參考株16S rRNA基因序列測定：完成54株分枝桿菌16S rRNA基因的上、下游序列測定，得到其雙向拼接結果。

2.3 54株分枝桿菌之間16S rRNA基因序列分析：通過54株分枝桿菌之間同源性序列比對 (見圖2)，繪制16S rRNA基因序列聚類分析樹狀譜 (見圖3)，計算株間相似百分比(見圖4)。發(fā)現(xiàn)其中11株分枝桿菌，即產(chǎn)鼻疽分枝桿菌(95012)與塞內加爾分枝桿菌 (95041)；潰瘍分枝桿菌 (95004)與海分枝桿菌(95014)；堪薩斯分枝桿菌 (95013)與胃分枝桿菌(95006)；3株結核分枝桿菌 (95052)(95053)(95054)與田鼠分枝桿菌 (95048)、非洲分枝桿菌(95049)16S rRNA基因序列完全相同無法鑒別，各組對之間相似性百分比為100%，其它43株分枝桿菌16S rRNA核苷酸序列長度及排列具有較高變異性，16S rRNA基因相似性百分比為91.7%～99.6%，所測定分枝桿菌的16S rRNA基因5′端既含有屬特異的保守區(qū)域，又含有兩個種特異的高變區(qū)，分別位于第60～170位核苷酸和位于第340～430位核苷酸區(qū)域。

3 討論

由于16S rRNA基因的長度適中，并且高變區(qū)序列具有細菌屬、種的特征，因而16S rRNA基因的序列測定已作為細菌分類和鑒定的“金標準”。本研究中16S rRNA基因序列分析可以對大部分分枝桿菌種進行準確鑒定，不足之處在于分枝桿菌種間16S rRNA基因多態(tài)性相對較低，常常無法區(qū)分某些親緣關系密切的種或同一菌種內的不同菌株，如研究中報道16S rRNA基因無法區(qū)分堪薩斯與胃分枝桿菌；塞內加爾與產(chǎn)鼻疽分枝桿菌；海與潰瘍分枝桿菌；MTC各成員[5，6]。要想對上述11株16S rRNA基因序列相互之間完全相同的分枝桿菌加以鑒別可能還要探索其他更有效的方法。

16 S rRNA基因序列分析與傳統(tǒng)生化方法相比GC和HPLC可以做到快速鑒定，但是兩者都需要昂貴的實驗儀器，檢測結果依賴于分枝桿菌標準的生長狀態(tài)，容易受不同溫度，不同培養(yǎng)基的影響，結果分析通常比較困難。16S rRNA基因分析并不需要標準的生長狀態(tài)，其更準確，更實用。文獻上報道[7]GC和HPLC不能鑒別M.triplex和 M.fortuitum，M.chelonae 和 M.abscessus，M.avium 和 M.intracellulare，在我們的研究中16S rRNA基因序列分析可以將其鑒別。

54 株國際參考株16SrRNA基因分析結果表明，該序列分析能將MTC和NTM相鑒別，將大部分NTM鑒定至種的水平。除16S rRNA基因外，近年來16S-23S rRNA ITS用于細菌菌種鑒定的研究也越來越多。在黃至澄[9]等的研究報道中16S-23S rRNA ITS序列分析不能鑒別灰塵(95030)與微黃分枝桿菌(95040)；田野(95043)與千田分枝桿菌(95046)；抗熱(95025)與副偶然分枝桿菌(95036)；奧布(95035)與母牛結核分枝桿菌(95051)；杜氏(95029)與豬分枝桿菌(95039)；金色(95027)與東海分枝桿菌(95038)。而在我們的研究中16S rRNA基因序列分析可以將其很好的鑒別，說明16S rRNA基因與16S-23S rRNA ITS是在不同水平上提供細菌種系發(fā)育鑒別的兩個靶基因。兩個靶基因結合分析可以將54株國際參考株的大部分分枝桿菌鑒別開，本研究進一步證實此方法的可靠性和實用性。

16 S rRNA基因分析要想成為一種臨床檢測的常規(guī)方法，還需要一個強大的質控序列數(shù)據(jù)庫；而目前的數(shù)據(jù)庫還不夠完善，甚至數(shù)據(jù)庫的有些信息是錯誤的。GenBank中也只能查到部分分枝桿菌標準株的16S rRNA基因序列，這在一定程度上限制了分子鑒定技術的臨床應用性。國際參考株為國內外分枝桿菌研究的標準對照株，起實驗質量控制作用。但到目前為止尚無54株國際參考株16S rRNA基因的系統(tǒng)研究報道。本研究為實現(xiàn)16S rRNA基因分析方法的常規(guī)性提供了重要的基礎條件。54株國際參考株為中國藥品生物制品檢定所收藏株，對標準株16S rRNA基因序列研究與公布為實現(xiàn)國家醫(yī)學微生物資料共享試點中分枝桿菌資源共享邁出第一步。

[1]溫博海.立克次體16S rRNA基因分析[J].中國人獸共患病雜志,1999,15(6):18-20.

[2]Turenne CY,Tschetter L,Wolfe J,et al.Necessity of quality-controlled 16S rRNA gene sequence databases:identify nontuberculous Mycobacterium species[J].J Clin Microbiol,2001,39:3637-3648.

[3]Cloud JL,Conville PS,Croft A,et al.Evaluation of partial 16S ribosomal DNA sequencing for identification of nocardia species by using the Micro Seq 500 system with an expanded database[J].J Clin Microbiol,2004,42:578-584.

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[5]Kirschner P,K Iekenbeck.Genetic heterogeneity within Mycobacterium fortuitum complex species:genotype criteria or identification[J].J C lin Microbiol,1991,30:2772-2775.

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Analysis of the genotype in 54 reference strains of Mycobacteria based on 16S rRNA gene sequences

YAN Lixia,HUANG Zhicheng,XU Qianning,et al.Taizhou First People's Hospital,Zhejiang Taizhou 318020,China

ObjectiveTo analyze the genotype in 54 reference strains of mycobacteria for the identification of clinical isolates.MethodsThe genotypes in 54 reference strains of mycobacteria were analyzed with 16S rRNA sequence,then phylogenetic tree was constructed and similarity was calculated.ResultsWith the sequencing of 16S rRNA in the 54 reference strains of mycobacteria,all the mycobacteria could be discriminated except M.farcinogenes and M.senegalense;M.ulcerans and M.marinum;M.gastri and M.kansasii;3 strains of M.tuberculosis and M.microti,M.africanum.Conclusions 16S rRNA gene sequence analysis is a reliable method to discriminate mycobacteria.The study of the genotype in 54 reference strains of Mycobacteria is compensation for Gene database.

Mycobacteria；16S rRNA；Reference strains

R378.91,R446.5

A

1674-1129(2011)05-0469-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.05.003

國家科技重大專項課題，編號：2009ZX10004-805

閆李俠，女，1981年1月生，畢業(yè)于蘭州大學臨床醫(yī)學院，碩士研究生，臨床檢驗診斷學專業(yè)，主管檢驗師，研究方向：微生物與分子生物學。