“紫娟”綠茶發(fā)酵過(guò)程中茶褐素理化性質(zhì)及微生物變化*

譚超，龔加順，保麗萍

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明，650201)

普洱茶是中國(guó)歷史名茶，是云南最具特色的名茶，距今已有1 700多年歷史［1］。普洱茶通過(guò)潮水固態(tài)發(fā)酵，蒸壓成型，沖泡湯色紅濃明亮，香氣獨(dú)特陳香，滋味醇厚回甘。茶葉中的色素化合物包括存在于鮮茶葉中的天然色素以及加工過(guò)程中形成的色素。這些色素是茶葉色澤、湯色及葉底色澤的基礎(chǔ)［2］。普洱茶茶色素屬于天然色素，是從普洱茶中提取的一類(lèi)水溶性酚性色素，包括茶黃素(TF)、茶紅素(TR)、茶褐素(TB)。而茶褐素系非透析性高聚物，主要組分是多酚類(lèi)、多糖、蛋白質(zhì)和核酸等。非透析性多酚含量會(huì)隨茶湯發(fā)熱而增加［3］。傳統(tǒng)普洱茶發(fā)酵過(guò)程中，因水熱的作用會(huì)促使茶黃素和茶紅素含量減少，而茶褐素含量增加。一般普洱茶中茶褐素含量為4% ～9%［4］。

“紫娟”茶屬于茶樹(shù)變種 (C.var.assamica)，是云南大葉群體茶樹(shù)品種中的一種特異品種，具有紫莖、紫葉、紫芽的特征，含較高的花青素。關(guān)于它的基本化學(xué)組成，特別是茶褐素目前的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。在“紫娟”普洱茶發(fā)酵過(guò)程中，微生物如何變化，對(duì)茶褐素、茶紅素等主體色素物質(zhì)形成有何影響等研究報(bào)道極少。本課題以“紫娟”曬青綠茶為原料，通過(guò)茶葉適度潮水后固態(tài)發(fā)酵，制成“紫娟”普洱茶。通過(guò)分析在不同發(fā)酵時(shí)間段，其中主要微生物含量變化和茶褐素的基本組成、理化性質(zhì)，闡明微生物與“紫娟”茶褐素形成的關(guān)系，明確“紫娟”茶褐素的理化性質(zhì)與光譜學(xué)性質(zhì)。為進(jìn)一步研究“紫娟”普洱茶茶褐素與普通普洱茶茶褐素的差異奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“紫娟”茶曬青綠茶(云南省茶葉研究所)。試劑:無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、葡聚糖(分子量10 000)、硫酸、蒽酮、考馬斯亮藍(lán)、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

101-3ABS恒溫恒濕發(fā)酵箱，寧波東南儀器有限公司制造;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津UV1700;紅外光譜儀，BIO-RAD FTS–40;氨基酸自動(dòng)分析儀，Hitachi L-8900;等離子體發(fā)射光譜儀，島津ICPS-7510;BCD-208K冰箱，青島海爾。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 “紫娟”普洱茶發(fā)酵

以“紫娟”曬青綠茶為原料(10 kg)，潮蒸餾水至茶葉含水量30%，靜止3 h讓水分充分被茶葉吸收，隨后將潮水后的“紫娟”茶原料放入45℃，相對(duì)濕度75%的恒溫恒濕發(fā)酵箱中發(fā)酵。發(fā)酵5 d取樣作為一翻樣;發(fā)酵10 d取樣作為二翻樣;發(fā)酵20 d取樣作為三翻樣;發(fā)酵30d取樣作為四翻樣。同時(shí)，分析各翻堆樣的微生物以及理化性質(zhì)。

1.3.2 茶褐素的提取流程

將茶樣加入70%乙醇溶液中浸泡4 h(去除醇溶性色素)，將浸泡后的茶渣再用85℃熱水浸泡2 h，過(guò)濾后取濾液并濃縮。濃縮液逐次用乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取，剩余水層加入無(wú)水乙醇至80%，沉淀茶褐素，收集沉淀，冷凍干燥。茶褐素含量分析方法參照文獻(xiàn)［5－6］。

1.3.3 茶褐素理化性質(zhì)的研究

(1)微生物分析:菌落總數(shù)測(cè)定參照 GB/T 4789.2－2008。霉菌與酵母菌檢測(cè)計(jì)數(shù)與菌落總數(shù)測(cè)定相似。樣品稀釋液的制備:稱(chēng)取茶樣10.00 g于250 mL錐形瓶并加入90 mL無(wú)菌水，置于靜音振蕩器上振蕩20 min，此液為1×10－1g/mL濃度的茶樣懸浮液，用無(wú)菌紗布在超凈臺(tái)上過(guò)濾并吸取1 mL的濾液于預(yù)先裝好9 mL無(wú)菌水的(18×18)mm的試管中，此液為1×10－2的茶樣稀釋液。以此類(lèi)推，制成 1 ×10－3、1 × 10－4、1 ×10－5、1 ×10－6、1 × 10－7g/mL等一系列稀釋濃度液，供平板接種用。本試驗(yàn)分離霉菌、酵母采用 10－4、10－5、10－6三個(gè)稀釋度;菌落采用10－2、10－3、10－4三個(gè)稀釋度。接種:將樣品稀釋液用1 mL的無(wú)菌吸管吸取1 mL放入到配制好、已滅菌的相應(yīng)培養(yǎng)基中，用接種刷把樣品液抹勻，放到(28±1)℃下培養(yǎng)4～5 d即可觀察鑒定及計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品采用3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度采取3重復(fù)。微生物的分離計(jì)數(shù):采用混合平板計(jì)數(shù)法。同一稀釋度各處理重復(fù)的菌落相差不能太大，霉菌以每皿10～100為宜，酵母、細(xì)菌以每皿30～300為宜。計(jì)算結(jié)果時(shí)，常按從接種后的3個(gè)稀釋度，選擇一個(gè)合適的稀釋度，計(jì)算出每毫升菌劑中的含菌量。計(jì)數(shù)公式:每毫升樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。

(2)多糖含量的測(cè)定［7］:蒽酮-硫酸法，以葡聚糖(分子質(zhì)量10 000)為標(biāo)準(zhǔn)品。

(3)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定［7］:考馬斯亮藍(lán)法，牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

(4)茶色素含量的測(cè)定［7］:萃取比色法。

(5)茶褐素總酸性基團(tuán)、總羥基、總羧基的測(cè)定［8］:茶褐素和氫氧化鋇反應(yīng)生成茶褐素的鋇鹽，用過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)酸中和氫氧化鋇，然后用標(biāo)準(zhǔn)的氫氧化鈉溶液回滴過(guò)量的酸測(cè)定總酸性基團(tuán)。茶褐素與醋酸鈣反應(yīng)生成茶褐素鈣和醋酸，然后用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定生成的醋酸，測(cè)定羧基。紅外光譜分析表明，茶褐素中的酸性基團(tuán)主要是羧基和酚羥基。因此，只要測(cè)出總酸性基團(tuán)的含量減去羧基含量即為酚羥基含量。

(6)氨基酸含量分析:采用酸水解法，利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定樣品中水解氨基酸含量。取100 mg樣品于水解管內(nèi)，加入15 mL濃度為6 mol/L的HCl，抽真空并封管，置于(110±1)℃恒溫干燥箱內(nèi)，水解22 h后，將管內(nèi)水解液過(guò)濾，取1 mL干燥并用1 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液溶解，供儀器測(cè)定用。

(7)礦物質(zhì)元素分析:等離子體發(fā)射光譜儀。

1.3.4 茶褐素光譜學(xué)性質(zhì)分析

(1)樣品的UV－vis分析:將“紫娟”茶褐素配成溶液，于190～1 100 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

(2)IR分析:將“紫娟”茶褐素經(jīng)KBr壓片，于紅外光譜上掃描分析，掃描范圍500～4 000 cm－1，分辨率為8 cm－1，掃描次數(shù)為16。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶葉中的茶褐素含量變化

茶褐素系指一類(lèi)能溶于水而不溶于乙酸乙酯、正丁醇和乙醇等有機(jī)溶劑的褐色色素。在普洱茶加工過(guò)程中，茶褐素的含量，對(duì)茶的品質(zhì)形成有十分重要的作用［9］。不同發(fā)酵階段“紫娟”茶葉中茶褐素含量結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可看出，在發(fā)酵的前20天，樣品中的茶褐素含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，第三翻樣品中的茶褐素含量達(dá)到最高(18.36%)，第四翻樣茶褐素含量又減少。這可能與微生物的變化密切相關(guān)，微生物數(shù)量在第三翻達(dá)到最高，而后數(shù)量急劇減少(見(jiàn)表2)。

表1 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶中茶褐素含量變化

表2 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶中微生物含量

劉勤晉等研究表明，普洱茶渥堆過(guò)程中黑曲霉(Asp.niger)生長(zhǎng)最為旺盛，其次是青霉、根霉和酵母［10］。通過(guò)對(duì)普洱茶發(fā)酵過(guò)程中的氧化酶(多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、抗壞血酸氧化酶)的活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中有強(qiáng)烈的多酚氧化酶和抗壞血酸氧化酶的活性。此前，我們對(duì)接種外源優(yōu)勢(shì)菌酵母菌發(fā)酵普洱茶過(guò)程中各種酶活性的結(jié)果變化顯示［11］，發(fā)酵10d后多酚氧化酶和纖維素酶活性達(dá)最高，分別從原料中的9.29 u/g和0.377u/g增加到34.2u/g和1.27 u/g;發(fā)酵20 d后，糖化酶活性由原料的8.23 u/mL增加到58.42 u/mL;發(fā)酵30d后，淀粉酶活性由原料的164.28 u/g增加到239.19 u/g;發(fā)酵40 d后，果膠酶活性由原料的0.08 u/mL增加到2.8 u/mL，過(guò)氧化氫酶活性由原料的5.6 u/mL增加到58.9 u/mL。

由此可見(jiàn)，在普洱茶發(fā)酵過(guò)程中，生物分泌的多種酶協(xié)同作用于茶葉，使茶葉內(nèi)含成分與酶分子間以及成分與成分間的相互接觸，特別是多酚氧化酶(PPO)酶促作用更為激烈，從而促進(jìn)了普洱茶品質(zhì)特征的形成，特別是茶褐素的大量形成。

2.2 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素中的多糖、蛋白質(zhì)、茶色素及酸性基團(tuán)含量變化

“紫娟”茶褐素在發(fā)酵過(guò)程中多糖、蛋白質(zhì)、茶色素等組成會(huì)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而變化，從表3可以得出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，茶褐素中的多糖、蛋白質(zhì)不斷增加，但到第四翻時(shí)，含量有一些下降，這可能是與微生物有很大關(guān)系，因?yàn)檫@一階段的微生物減少了很多，從而影響了多糖、蛋白質(zhì)的含量。不同茶樣提取的茶褐素中的茶色素含量也有明顯變化，從整體變化趨勢(shì)看，茶黃素和茶紅素的含量是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷地減少的，茶褐素的含量則不斷地增加。然而，茶黃素和茶紅素的減少量并不等于茶褐素的增加量，均小于茶褐素的增加量。這種量的差別可能顯示茶褐素的形成并不只是通過(guò)茶黃素和茶紅素轉(zhuǎn)化而來(lái)，還可能有多糖、蛋白質(zhì)的參與。活性基團(tuán)總羥基及總羧基的變化復(fù)雜，僅總羧基的變化與微生物、茶褐素的變化規(guī)律一致，這顯示普洱茶的發(fā)酵是一個(gè)非常復(fù)雜的化學(xué)變化過(guò)程。

表3 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素中多糖、蛋白質(zhì)、茶色素及酸性基團(tuán)含量

2.3 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素中主要氨基酸含量

從表4得出，單體氨基酸如天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，含量不斷減少;而蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸以及水解氨基酸總量等均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，含量不斷增加。賴(lài)氨酸、組氨酸、精氨酸這3種氨基酸的含量先是不斷增加，發(fā)酵10d后含量達(dá)到最高，而后逐漸下降。單體氨基酸含量的變化反映了與茶褐素結(jié)合的蛋白質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間也在變化。

表4 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素中主要氨基酸的含量

續(xù)表4

2.4 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素的礦物質(zhì)含量

測(cè)定茶褐素中礦物質(zhì)元素的含量，可反映茶褐素結(jié)合基團(tuán)的變化，特別是羧基、羥基的變化。由表5可知，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，“紫娟”茶褐素中礦物質(zhì)元素的含量呈下降趨勢(shì)。硫、磷、鉀、鎂、鋅、錳元素的含量，總趨勢(shì)是隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而下降，而鈣、鐵、銅元素的含量，總趨勢(shì)是隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，先逐漸減小，到發(fā)酵30d時(shí)(第四翻)又逐漸增加。鉀元素的含量最高。對(duì)比檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，普洱茶速溶茶粉中鉀元素的含量可達(dá)7%。這些礦物質(zhì)元素的變化可能與微生物的滋生、繁殖有密切的關(guān)系。

表5 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素中礦物質(zhì)含量/(mg/kg)

2.5 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素UV－vis性質(zhì)

不同發(fā)酵時(shí)間的“紫娟”茶褐素樣品在280 nm左右處均有一個(gè)吸收峰，此處是蛋白質(zhì)和核酸的最大吸收峰。因此，不論經(jīng)過(guò)多長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵，“紫娟”普洱茶提取的茶褐素中都含有一定量的蛋白質(zhì)和核酸。樣品在200 nm左右有最大吸收峰，有研究表明，植物多糖糖苷的最大吸收峰在200nm左右，說(shuō)明在茶湯中可能含有小分子糖形成的糖苷或多糖復(fù)合產(chǎn)物存在。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間“紫娟”茶褐素的UV－vis

2.6 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素IR性質(zhì)

由圖3得出，“紫娟”普洱茶不同發(fā)酵階段茶褐素提取物的紅外光譜圖差異不大;茶褐素提取物在3 410 cm－1處的強(qiáng)寬吸收峰為 O—H伸縮振動(dòng);在3 600～3 000 cm－1范圍內(nèi)出現(xiàn)的寬峰還可能包含N—H伸縮振動(dòng);2 929 cm－1處為亞甲基的C-H伸縮振動(dòng)峰，1 626 cm－1處為C=O的伸縮振動(dòng)峰，結(jié)合1 531 cm－1處的吸收峰可以判斷該處可能還含有芳環(huán)骨架振動(dòng)引起的吸收，1 409 cm－1處為COO-的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰;1 313 cm－1處為芳香族的C—N伸縮振動(dòng)峰，1 242 cm－1處為酚的 C—O的伸縮振動(dòng)峰，1 098、1 050 cm－1兩處為 C—O—C的伸縮振動(dòng)峰，787、701 cm－1兩處為苯環(huán)的C—H面外曲振動(dòng)?！白暇辍辈韬炙貫槎嗔u基酚類(lèi)物質(zhì)，并含有羧基，結(jié)合有蛋白質(zhì)和多糖，更確切的基團(tuán)情況尚需進(jìn)一步做其他的相關(guān)分析來(lái)確定。

圖3 不同發(fā)酵階段“紫娟”茶褐素紅外光譜圖

3 討論

微生物在普洱茶的發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用［12－13］。測(cè)定不同發(fā)酵階段(不同翻堆)樣“紫娟”普洱茶的微生物指標(biāo)，從表2可以得出，樣品中的菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌數(shù)量隨著發(fā)酵的時(shí)間的延長(zhǎng)，呈上升趨勢(shì)。在“紫娟”原樣中，含有一些本身就攜帶的微生物，這對(duì)不接種任何微生物，只是控制發(fā)酵溫度和濕度的普洱茶發(fā)酵過(guò)程是非常有利的。這些微生物在恒溫恒濕的條件下迅速滋生、繁殖，表現(xiàn)出來(lái)的就是一翻樣中的微生物數(shù)量都增長(zhǎng)了很多。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物的數(shù)量繼續(xù)增多，在三翻，即發(fā)酵20d的時(shí)候達(dá)到微生物數(shù)量的最高點(diǎn)，隨后，微生物的數(shù)量急劇的減少，這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵到達(dá)一定的時(shí)期，普洱茶中能供給這些微生物生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)差不多耗盡，微生物的數(shù)量就會(huì)減少很多。

“紫娟”普洱茶在發(fā)酵前后變化明顯，從掃描電鏡圖片(圖4)可以看出。茶原樣中微生物含量較少，而四翻中則存在大量微生物。發(fā)酵前，茶葉表面比較完整光滑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、纖維素、木質(zhì)素等沒(méi)有被破壞。而曬青綠茶經(jīng)發(fā)酵后，茶葉表面長(zhǎng)滿微生物，并且茶葉結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞。兩組電鏡圖的直觀對(duì)比，說(shuō)明微生物一方面生長(zhǎng)需要碳源，同時(shí)，又可分泌一些酶將茶葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，組成成分纖維素、半纖維素、原果膠等物質(zhì)被降解。可見(jiàn)微生物在普洱茶發(fā)酵中起了重要作用。

圖4 “紫娟”茶葉一翻樣和四翻樣掃描電鏡圖(“紫娟”原樣(a);“紫娟”四翻樣(b))

“紫娟”普洱茶中的成分在發(fā)酵的中后期呈現(xiàn)明顯的增減變化。關(guān)于微生物的變化。何國(guó)藩、林月禪、徐福祥等人［14］的研究表明，渥堆早期霉菌最先發(fā)展起來(lái)，酵母菌早渥堆開(kāi)始幾天數(shù)量甚少，到中后期大量發(fā)展起來(lái)，成了優(yōu)勢(shì)菌種。這是因?yàn)槊咕芾酶鞣N多糖作為碳源，代謝的結(jié)果產(chǎn)生了大量的雙糖和單糖，使酵母有了足夠的營(yíng)養(yǎng)。普洱茶以曬青毛茶作為原料，經(jīng)發(fā)水、渥堆陳化及干燥工序精制而成的后發(fā)酵茶。渥堆陳化實(shí)際上是在酶促作用、濕熱作用和微生物的作用下共同完成的，但微生物起最主要的作用。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)茶褐素中含有多糖和蛋白質(zhì)。要對(duì)茶褐素的化學(xué)結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步的分析，就需要將茶褐素進(jìn)行分離純化，才能得到更加準(zhǔn)確的分析結(jié)果，而如何將茶褐素分離純化，在以后的研究中是重點(diǎn)需要攻克的地方。

4 結(jié)論

(1)“紫娟”茶葉中菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌數(shù)量以及茶褐素提取量變化隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增后降的變化;茶褐素組成中的多糖、蛋白質(zhì)殘基等含量不斷增加，茶色素含量、總羥基及總羧基的含量變化明顯，天門(mén)冬氨酸、谷氨酸等含量不斷減少;而蘇氨酸、絲氨酸等含量不斷增加。賴(lài)氨酸、組氨酸、精氨酸的含量先增加后下降。礦物質(zhì)元素硫、磷、鉀、鎂、鋅、錳元素的含量下降，鈣、鐵、銅元素的含量先逐漸減小后逐漸增加。

(2)UV－vis表明，不同發(fā)酵時(shí)間“紫娟”茶褐素在200nm處有一個(gè)最大吸收峰，280nm左右有一個(gè)特征吸收峰。IR表明，“紫娟”普洱茶茶褐素為多羥基酚類(lèi)物質(zhì)，并含有羧基，結(jié)合有蛋白質(zhì)、多糖。

(3)霉菌和酵母菌對(duì)“紫娟”茶褐素的形成起重要作用，影響了茶褐素的理化性質(zhì)，特別是化學(xué)組成。

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