果膠酶高產(chǎn)菌株的紫外線及硫酸二乙酯的誘變育種

由田，宋剛，凌紅志，葛菁萍

(黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080)

果膠酶是能分解果膠質(zhì)的一類含多種酶的復(fù)合酶，普遍存在于植物果實(shí)和微生物中。在自然界中，果膠質(zhì)廣泛存在于高等植物中，是植物體中一類復(fù)雜的膠體性糖類，它是由D半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵形成的直鏈狀聚合物，是植物細(xì)胞間的胞間層和初生壁的重要組分，在麻纖維中含量較高。由于果膠質(zhì)在植物的細(xì)胞組織中起著“粘和”作用，一旦植物組織中的果膠質(zhì)分解便引起細(xì)胞的離散［1］。通過(guò)果膠酶的作用，可將果膠質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，從纖維中游離出來(lái)，可使與其粘合在一起的其他雜質(zhì)(如蠟質(zhì)、蛋白質(zhì)、灰份等)與纖維素徹底分開(kāi)，達(dá)到麻脫膠的目的［2］。果膠酶產(chǎn)生菌在漚麻過(guò)程中的應(yīng)用可使?jié)a麻周期縮短，提高亞麻纖維的質(zhì)量及出麻率。誘變育種方法雖然是不定向變異，但誘變結(jié)果相對(duì)于單純的培養(yǎng)基選育均有較大的突變率。菌種通過(guò)合適的誘變，能更好地選育出產(chǎn)酶量更高、酶學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定、針對(duì)性更強(qiáng)的新菌株［3］。目前以輻照誘變和化學(xué)誘變較為多見(jiàn)，且效果較好。李延生等［4］使用微波誘變表明，誘變的突變率較大，且最高正突變發(fā)生的酶活力都要高出數(shù)十個(gè)百分點(diǎn)。Hadj-Taieb Noomen［5］采用亞硝酸對(duì)青霉菌(Penicillium occitanis)進(jìn)行誘變，得到1株突變型菌株CT1，該菌株產(chǎn)酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原始菌株，并且不需果膠或其他類似物的誘導(dǎo)，降低了生產(chǎn)成本。本文是以黑龍江省巴彥亞麻有限公司漚麻池中分離篩選出的HDYM-02為出發(fā)菌株，用紫外線及硫酸二乙酯進(jìn)行誘變，從大量突變株中進(jìn)行篩選，最終得到產(chǎn)酶高峰較早及產(chǎn)酶效率高的突變株UV-21和DES-1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種果膠酶產(chǎn)生菌HDYM-02，從黑龍江巴彥亞麻有限公司漚麻池中分離篩選得到，經(jīng)形態(tài)觀察，生理生化特性和16S rDNA序列分析，判定其屬于芽胞桿菌屬(Bacillus)，由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基試管斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;分離培養(yǎng)基：果膠4 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0～7.2，115℃20 min滅菌;發(fā)酵培養(yǎng)基：①種子發(fā)酵液：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0～7.2，121℃15 min滅菌;②擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵液：果膠粉4 g，蛋白胨10 g，NaCl 15 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0～7.2，115℃20 min滅菌;初篩培養(yǎng)基：上層：果膠0.2%(質(zhì)量與體積比)、瓊脂粉2%(質(zhì)量與體積比)，10 mL;下層：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基20 mL(直徑11 cm的大平板)。

1.1.3 試劑染色劑0.1%(質(zhì)量與體積比)剛果紅溶液;洗脫液1 mol/L NaCl溶液;DNS試劑。

1.2 方法

1.2.1 菌種的純化將HDYM-02的保藏菌種在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后接入種子發(fā)酵液，37℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，離心洗滌菌體，制備菌懸液，稀釋涂布于分離培養(yǎng)基平板。待菌落長(zhǎng)出后，挑單菌落純化。選擇完全純化的菌種作為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變育種。

1.2.2 HDYM-01的誘變育種［6-8］①紫外線誘變處理：a.菌懸液的制備：取培養(yǎng)24 h的純化后的斜面，接2環(huán)菌至30 mL種子發(fā)酵液，37℃、120 r/min搖床培養(yǎng)18 h，3 000 r/min離心20 min，棄上清，用無(wú)菌生理鹽水離心洗滌2次，沉淀用生理鹽水調(diào)成108cfu/mL的菌懸液;b.紫外線處理過(guò)程：先將15 W紫外燈預(yù)熱30 min，移4 mL菌懸液至直徑為6 cm的無(wú)菌平皿中(內(nèi)置磁力轉(zhuǎn)子)置于磁力攪拌器上，距離30 cm，照射時(shí)間設(shè)為10、15、20、30、40 s;c.誘變后的處理：在紅燈照射下，將照射后的菌液以10倍梯度稀釋法稀釋為10-1～10-7，取3個(gè)適當(dāng)稀釋度菌液涂布于分離培養(yǎng)基中，每只平板加稀釋液0.2 mL，每個(gè)稀釋度涂平板3只，以同樣操作取未經(jīng)紫外照射的平板作對(duì)照，用黑布包好，置37℃培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)并計(jì)算致死率。挑取致死率在70～80%的單菌落，中間培養(yǎng)后進(jìn)行初篩;②硫酸二乙酯誘變處理：a.菌懸液的制備：將HDYM-02接2環(huán)菌至30 mL種子發(fā)酵液中，37℃、120 r/min搖床培養(yǎng)18 h，3 000 r/min離心20 min，棄上清，用0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液30 mL離心洗滌2次，將沉淀下來(lái)的菌體用磷酸緩沖液懸浮稀釋，并將菌懸液調(diào)至濃度為107～108cfu/mL;b.硫酸二乙酯處理過(guò)程：取菌懸液4 mL加入裝有16 mL的磷酸緩沖液中，再加入硫酸二乙酯0.2 mL，按規(guī)定時(shí)間(30、60 min)處理，用0.5 mL 25%(質(zhì)量與體積比)的硫代硫酸鈉溶液中止反應(yīng);c.誘變后的處理：中止反應(yīng)后的菌液用生理鹽水離心洗滌3次，梯度稀釋至10-4、10-5、10-6，涂布分離培養(yǎng)基平板后培養(yǎng)(與紫外線處理同)。

1.2.3 突變株的篩選①剛果紅染色法初篩［9］：將出發(fā)菌株及誘變后的菌株，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)12 h，待菌落長(zhǎng)出后，于其上鋪上層初篩培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后用0.1%的剛果紅染色劑染色15 min，傾去染色劑，用1 mol/L NaCl溶液蕩洗平板15 min，靜置待透明圈顯現(xiàn)后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明圈直徑(H)及菌落直徑(C)，計(jì)算H/C值，挑選H/C值大于出發(fā)菌株的突變菌株進(jìn)行復(fù)篩(測(cè)定酶活);②酶活力測(cè)定方法［1，10］：接2環(huán)進(jìn)行復(fù)篩的菌株于種子發(fā)酵液培養(yǎng)18 h，按3%的接種量接入擴(kuò)大培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)6、12、24、48、72 h時(shí)取出菌液，測(cè)定其OD590nm，離心棄沉淀，上清液即為粗酶液。取0.25%(質(zhì)量與體積比)的果膠溶液(用pH 6.8的磷酸緩沖液配制)1 mL于試管中，加磷酸緩沖液2 mL 50℃水浴中平衡后，加入適當(dāng)稀釋的酶液1 mL保溫30 min，用DNS法測(cè)定水解產(chǎn)生的還原糖。在上述條件下，每分鐘由底物產(chǎn)生1 μmol還原糖(以半乳糖醛酸計(jì))所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變處理

2.1.1 最佳誘變劑量的確定表1為不同照射時(shí)間的誘變效果，隨著照射時(shí)間的加長(zhǎng)，致死率也在逐漸增加，到40 s時(shí)，致死率已接近100%。一般來(lái)說(shuō)，致死率在70%左右時(shí)其正變率也較高。由表1可知，紫外線照射10、15 s的致死率均在70%～80%之間。為保證有較高的篩選機(jī)率，選擇15 s的UV照射劑量。

表1 不同紫外線照射時(shí)間下的致死率Table 1 Lethality from different time of UV irradiation

2.1.2 UV照射后突變株的選育以HDYM-02作為出發(fā)菌株，UV照射15 s后，通過(guò)剛果紅染色初篩挑選H/C較大的菌株。共獲得7株突變株(圖1)，分別為UV-1、UV-2、UV-3、UV-5、UV-18、UV-19和UV-21，其H/C分別為4.042、3.833、4.313、4.261、4.245、4.138、5.694，均大于對(duì)照出發(fā)菌株(H/C為3.280)。

圖1 UV誘變的7株突變株的剛果紅染色初篩結(jié)果Fig.1 The result of Congo red staining of 7 mutant strains by mutating with UV

對(duì)此7株突變株進(jìn)行酶活測(cè)定，復(fù)篩結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，UV-21在24 h時(shí)酶活力為49 U達(dá)到產(chǎn)酶高峰期，而此時(shí)出發(fā)菌株的酶活力僅為31 U，前者是后者的1.6倍。其他突變株的酶活力效果不十分理想，UV-18和UV-5分別在48 h和72 h才到達(dá)產(chǎn)酶高峰，其余菌株的產(chǎn)酶高峰均低于出發(fā)菌株。

圖27 株突變株的復(fù)篩酶活測(cè)定結(jié)果Fig.2 The pectinase activities of 7 mutant strains

2.2 硫酸二乙酯(DES)誘變處理

以HDYM-02為出發(fā)菌株，經(jīng)DES多次誘變，通過(guò)初篩挑選出3株突變株(圖3)，分別為DES-1、DES-2、DES-3，其H/C分別為4.164、4.134、4.263，均大于對(duì)照出發(fā)菌株(H/C為3.638)。對(duì)這3株突變株進(jìn)行復(fù)篩的結(jié)果如圖4。

由圖4可知，DES-1在12 h時(shí)的酶活力為39 U達(dá)到產(chǎn)酶高峰，而此時(shí)出發(fā)菌株的酶活力為27 U，說(shuō)明DES-1的產(chǎn)酶期提前，且12 h的酶活力是出發(fā)菌株的1.44倍。如果將DES-1投入生產(chǎn)其產(chǎn)酶高峰早可以使?jié)a麻期縮短。

3 討論

本研究采用的紫外線誘變處理方法簡(jiǎn)便，效果好，危險(xiǎn)性又小，而DES是一種較強(qiáng)的誘變劑，致死率很高，但誘變效果不是很理想，可能是因?yàn)橐吧陮?duì)誘變劑很敏感，易發(fā)生突變，而經(jīng)多次誘變處理后回復(fù)突變就比較明顯［7，11］。對(duì)篩選方法即剛果紅染色法的進(jìn)一步改善，得到了一套實(shí)用的誘變及篩選的方案。最終通過(guò)誘變和篩選的交替，得到2株HDYM-02的突變株UV-21和DES-1，它們的產(chǎn)酶高峰早且產(chǎn)酶效率高，符合投入生產(chǎn)的需要。

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