黑曲霉原生質(zhì)體誘變選育果膠酶高產(chǎn)菌株

陳林，王明茲，柯崇榕，高媛媛，莊秀紅，楊章萍，?？∥。S建忠

(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福建福州350108)

果膠是一種廣泛存在于植物界中的高分子聚糖化合物，是植物細胞壁的重要組成成分［1］。果膠酶是能分解果膠類物質(zhì)的復(fù)合酶，通常包括原果膠酶(Protopectinase)、果膠酯酶(Pectinesterase)和果膠解聚酶(Depolymerizing enzymes)［2］。果膠酶是人們生活中最早應(yīng)用的酶類之一，也是當(dāng)前世界四大酶制劑之一［3］，廣泛應(yīng)用于果蔬汁的生產(chǎn)和澄清［4］、天然產(chǎn)物提取、紡織品生物脫膠［5］、造紙生物制漿、食品加工以及單細胞產(chǎn)品生產(chǎn)等［6］。果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)均采用微生物發(fā)酵方法進行，選育果膠酶高產(chǎn)菌株是國內(nèi)外果膠酶研究熱點。Nakkeeran等［7］篩選到1株碳黑曲霉As-pergillus carbonarius，通過深層固體發(fā)酵聚半乳糖醛酸酶酶活力高達7 000 U/mg;杜國軍等［8］通過紫外誘變選育了1株果膠酶活力為2 000 U/g的黑曲霉HY。黑曲霉(A.niger)是國際公認的安全菌株(GRAS)，也是美國(FDA)認可使用安全的產(chǎn)酶微生物之一。黑曲霉產(chǎn)生的果膠酶酶系最全，可直接用于食品工業(yè)。黑曲霉EIM6是楊欣偉等［9］篩選獲得的1株果膠酶高產(chǎn)菌株，其果膠酶活力可達46 598.08 U/mL。本文采用UV和NTG原生質(zhì)體誘變技術(shù)，篩選高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉突變株，為發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶提供穩(wěn)定的生產(chǎn)菌株，具有一定的理論和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株黑曲霉(Aspergillus niger)EIM6，由福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心保藏。1.1.2培養(yǎng)基孢子產(chǎn)生與菌絲生長培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基［10］;原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基(添加NaCl 0.5 mol/L);發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(%)：甜菜渣2.8，橘皮粉4.0，KH2PO40.8，(NH4)2SO40.4，CaCO30.6，自然pH;篩選平板(%)：果膠0.2，瓊脂2.0。

1.2 方法

1.2.1 果膠酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)［9］測定果膠酶活力。1個酶活力單位定義為在50℃，pH 3.5的條件下，1 min水解果膠產(chǎn)生1 μg還原糖(以半乳糖醛酸計算)所需的酶量。

1.2.2 黑曲霉EIM6原生質(zhì)體的制備及再生取-80℃保藏的黑曲霉菌種1管，接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28℃活化培養(yǎng)4～6 d。將生長旺盛的斜面孢子轉(zhuǎn)接于液體PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)20 h，用擦鏡紙過濾收集菌絲。將菌絲置于Φ=6 cm培養(yǎng)皿中，添加1.5%溶壁酶和1.5%纖維素酶于30℃、60 r/min搖床上進行酶解2 h制備原生質(zhì)體［11］，4 000 r/min離心5 min，高滲穩(wěn)定劑洗滌重懸獲得106cfu/mL的原生質(zhì)體懸液。

1.2.3 黑曲霉原生質(zhì)體UV誘變?nèi)? mL原生質(zhì)體懸液于Φ=6 cm的培養(yǎng)皿中，置于磁力攪拌器上于15 W紫外燈下30 cm處進行誘變。分別于30、60、90、120、150、180、210、240 s時間點取樣，用雙層平板法再生，計算致死率。

1.2.4 黑曲霉原生質(zhì)體NTG誘變將原生質(zhì)體懸液分別用不同濃度NTG誘變處理30 min，濃度分別為0、25、50、100、150、200、250、300、350 μg/mL，誘變后用雙層平板法再生，計算致死率。

1.2.5 高產(chǎn)突變株的初篩和復(fù)篩將再生后的單菌落移至初篩平板靜置8 h，剛果紅染色30 min，1 mol/L NaCl溶液浸泡1h，挑取透明圈較大的菌落到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)純化［9］。挑取初篩菌的成熟孢子至30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵復(fù)篩。接種量為107cfu/mL，發(fā)酵條件為28℃，250 r/min，培養(yǎng)80 h后測定發(fā)酵液中果膠酶活力。

1.2.6 突變株遺傳穩(wěn)定性分析將經(jīng)UV和NTG誘變篩選獲得酶活力最高的2個菌株經(jīng)8次連續(xù)傳代培養(yǎng)，測定其果膠酶活力，分析果膠酶高產(chǎn)突變株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備原生質(zhì)體

黑曲霉菌絲體在酶的作用下，菌絲斷裂形成原生質(zhì)體。酶解1 h，大部分菌絲斷裂成小段，形成部分原生質(zhì)體(圖1a所示);酶解2 h，大量原生質(zhì)體產(chǎn)生(圖1b所示)。因此，選用酶解2 h制備形成的原生質(zhì)體進行誘變實驗。

圖1 黑曲霉EIM6原生質(zhì)體釋放過程Fig.1 Protoplast release from Aspergillus niger EIM6

2.2 原生質(zhì)體UV誘變突變株篩選

紫外照射的時間和致死率成正比，0～50 s內(nèi)隨著紫外照射時間延長原生質(zhì)體死亡率迅速上升(圖2)，據(jù)報道［12］采用70%～80%致死率的原生質(zhì)體正突變率較高。本實驗采用25 s的UV(75%致死率)誘變來篩選果膠酶高產(chǎn)突變株。

雙層平板法進行原生質(zhì)體再生，隨機挑選1 000個再生菌株轉(zhuǎn)接于初篩平板(圖3)，選取透明圈最大的25個單菌落進行復(fù)篩。搖瓶復(fù)篩表明，15個突變株的果膠酶活力均有不同程度的提高，其中EIM6-U11酶活力最高，可達69 347.3 U/mL，比出發(fā)菌株提高了48.82%(圖4)。

2.3 原生質(zhì)體NTG誘變突變株篩選

NTG的濃度和致死率成正比，隨著NTG濃度的增加，原生質(zhì)體的致死率迅速上升(圖5)。本實驗采用濃度為50 μg/mL NTG誘變原生質(zhì)體來篩選果膠酶高產(chǎn)突變株。

圖5 NTG誘變致死率Fig.5 The lethality rate of protoplasts from Aspergillus niger EIM6 mutagenesis by NTG

NTG誘變篩選方法和紫外誘變篩選方法相同，從再生培養(yǎng)平板的單菌落中，用打瓊脂塊法挑取約1 000株誘變株于初篩平板上，染色洗脫后挑取透明圈較大的15個單菌落，轉(zhuǎn)接至PDA斜面進行培養(yǎng)，3 d后接種至復(fù)篩發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進行發(fā)酵和測酶活力(圖6)。

圖6 NTG誘變果膠酶高產(chǎn)菌株Fig.6 High pectinase production strain from mutagenesis by NTG

2.4 高產(chǎn)菌株EIM6-U11、EIM6-N5傳代穩(wěn)定性

為了分析突變株的遺傳穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳代8次，然后分別測定其果膠酶活力，結(jié)果見表1。表1表明，在95%置信范圍內(nèi)，高產(chǎn)突變株EIM6-U11和EIM6-N5的酶活力和后代酶活力值相近，差異不顯著(P＞0.05)，可見突變株EIM6-U11和EIM6-N5具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

表1 突變株EIM6-U11和EIM6-N5的遺傳穩(wěn)定性Table 1 The genetic stability of EIM6-U11 and EIM6-N5

3 結(jié)論與討論

原生質(zhì)體一般是用對數(shù)生長期的細胞制備而來，其代謝旺盛、復(fù)制頻繁。由于原生質(zhì)體剝?nèi)チ思毎冢瑢φT變劑敏感性較強，往往正突變率高，并且誘變后易于形成單菌落而便于篩選，所以本實驗對黑曲霉EIM6原生質(zhì)體進行UV和NTG誘變來選育果膠酶高產(chǎn)突變株。實驗表明黑曲霉EIM6的原生質(zhì)體對UV和NTG比較敏感，采用原生質(zhì)體誘變技術(shù)選育EIM6果膠酶高產(chǎn)突變株可行。誘變后進行果膠酶高產(chǎn)突變株的篩選，挑取生長較快和菌落直徑較大的單菌落進行透明圈法初篩，并且通過DNS法定量測定發(fā)現(xiàn)菌株透明圈大小與酶活力成正比關(guān)系，說明此初篩方法穩(wěn)定且有高通量性。原生質(zhì)體進行UV和NTG誘變后獲得2株果膠酶活力明顯提高的突變株：EIM6-U11和EIM6-N5，果膠酶活力分別為68 596.57 U/mL和68 879.56 U/mL。本實驗得到的突變株產(chǎn)果膠酶水平在國內(nèi)選育研究中處于較高水平，并可對其進一步改造提高產(chǎn)酶水平。此外，由于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶于深層液體發(fā)酵相比，有酶活力高、發(fā)酵成本低的優(yōu)點，國內(nèi)果膠酶的工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中，固體發(fā)酵生產(chǎn)方式占主導(dǎo)地位，所以還可以通過對EIM6-U11和EIM6-N5固體發(fā)酵條件優(yōu)化進一步提高果膠酶產(chǎn)量。

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