綿羊FGF5基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

劉伍限，賈斌，石國慶，2

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子832003；2新疆農(nóng)墾科學(xué)院，石河子832000）

利用生物信息學(xué)分析基因和蛋白質(zhì)的序列模式，不僅可以對基因的分子進(jìn)化和相似性進(jìn)行研究，也可以進(jìn)一步研究基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)將克隆獲得的綿羊FGF5基因，借助生物信息學(xué)手段，對其編碼蛋白進(jìn)行了蛋白理化特性、氨基酸序列以及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，以期為進(jìn)一步研究FGF5基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)與調(diào)控及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

Taq DNA聚合酶和pMDTM18－T Vector購自TaKaRa公司，dNTP（s），PCR引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，DL2000DNA Ladder購自天根公司，感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）購自美國Novagen公司，大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 方法

1．2．1 引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

參照牛FGF5基因（NM_001078011），并運(yùn)用軟件Primer 2．0在其保守性區(qū)域設(shè)計(jì)引物，上游引物為 5′－ATGAGCTTGTCCTTCCTCCT－3′，下 游 引物為5′－TTAACCAAAGCGAAACTTGA－3′，引物送于北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。以綿羊皮膚組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到目的基因。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1．2．2 FGF5基因的克隆和測序

將PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳并回收，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化連接到pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，酶切鑒定后由北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交網(wǎng)站比對，以檢測是否為需要的序列。

1．2．3 序列分析

利用Vector NTI Suite 8中ORF finder確定其完整編碼區(qū)（CDS）獲得其正確氨基酸編碼序列；運(yùn)用蛋白在線分析工具及軟件對該蛋白進(jìn)行各級結(jié)構(gòu)及特征分析：采用 ProtParam（http：／／au．expasy．org／cgi－bin／protparam）程序，預(yù)測 FGF5蛋白分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；采用SOSUI（http：／／bp．nuap．nagoya－u．a(chǎn)c．jp／sosuil／）程序，分析 FGF5蛋白的可溶性；采用DNAMAN軟件，分析FGF5蛋白的親（疏）水性，并預(yù)測其親水性高的區(qū)域；采用MotifScan（http：／／myhits．isb－sib．ch／cgi－bin／motif_scan）程序，預(yù)測蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)；采用TMH－MM2．0服務(wù)器對蛋白進(jìn)行跨膜分析；利用SignalP 3．0系統(tǒng)預(yù)測FGF5蛋白的信號肽序列；通過TargetP 1．1和PSORTⅡprediction在線軟件進(jìn)行綿羊FGF5蛋白的細(xì)胞定位分析；采用HNN軟件 （http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa－automat．pl），分析FGF5蛋白的二級結(jié)構(gòu)；通過Gene Runner軟件和DNAMAN軟件，分析FGF5蛋白潛在的抗原表位，預(yù)測其免疫原性。

當(dāng)然，簡約的課堂，不僅是學(xué)情了解、教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)主線、教學(xué)結(jié)構(gòu)、教學(xué)方法、教學(xué)評價(jià)上的簡約，還包括了簡練的教學(xué)語言、精致的教學(xué)練習(xí)、簡易的教學(xué)手段、適當(dāng)?shù)拿浇閼?yīng)用等。簡約不是簡單的刪減，是“豪華落盡見真淳，鉛華洗卻見本色”的濃縮，是“三言兩語是精華，一枝一葉總關(guān)情”。課堂的高效理應(yīng)從簡約開始！

2 結(jié)果與分析

2．1 綿羊FGF5基因cDNA的克隆

根據(jù)牛的同源保守區(qū)域，并運(yùn)用Primer 2．0在其同源性高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，以綿羊皮膚cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條813bp的目的條帶（圖1），經(jīng)克隆、酶切鑒定和測序、BLAST比對確定為綿羊FGF5基因cDNA序列。

圖1 綿羊FGF5基因片段的克隆Fig．1Cloning of FGF5gene in sheep

2．2 FGF5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

綿羊FGF5基因所編碼的蛋白由270個(gè)氨基酸組成（圖2），其氨基酸組成中亮氨酸的含量高達(dá)14．8%，遠(yuǎn)高于其它氨基酸的含量。其分子質(zhì)量單位為29．584 7ku，分子式為C1315H2085N389O378S6，等電點(diǎn)理論值為10．59，含有4個(gè)半胱氨酸，假設(shè)形成2個(gè)二硫鍵，則其在水溶液中摩爾消光系數(shù)為25565M－1cm－1，0．1%濃度（1g／L）的 Abs為0．864，當(dāng)二硫鍵全部打開時(shí)，對應(yīng)值分別為25440M－1cm－1和0．860。成熟蛋白N端為蛋氨酸時(shí)，預(yù)測半衰期值哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞體外表達(dá)當(dāng)中為30h，酵母和大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)分別大于20h和10h。在溶液當(dāng)中不穩(wěn)定指數(shù)為56．83，高于閾值40，為不穩(wěn)定蛋白。

圖2 FGF5基因預(yù)測的氨基酸序列Fig．2The predicted amino acid sequence of FGF5gene

2．3 FGF5蛋白的可溶性和親（疏）水性

FGF5蛋白的平均親水性系數(shù)為－0．55，為可溶性蛋白。采用DNAMAN軟件分析，F(xiàn)GF5蛋白具有多個(gè)親水性高的區(qū)域（圖3）。

圖3 FGF5蛋白的親／疏水性Fig．3Hydrophilic and hydrophobic profile of the protein of FGF5

2．4 FGF5翻譯后修飾和結(jié)構(gòu)特征序列

通過翻譯后修飾位點(diǎn)分析，理論推測該蛋白含有7個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)，分別為：1個(gè)酰胺化位點(diǎn)（86～89位氨基酸）、1個(gè) ASN－糖基化位點(diǎn)（112～115位氨基酸）、1個(gè)環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（47～50位氨基酸）、4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（74～77位氨基酸，121～124位氨基酸，186～189位氨基酸，234～237位氨基酸）、5個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)（42～47位氨基酸，70～75位氨基酸，91～96位氨基酸，113～118位氨基酸，137～142位氨基酸）、9個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（37～39位氨基酸，45～47位氨基酸，86～88位氨基酸，140～142位氨基酸，147～149位氨基酸，155～157位氨基酸，183～185位氨基酸，186～188位氨基酸，260～262位氨基酸）、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（167～173位氨基酸）。

2．5 綿羊FGF5蛋白的跨膜分析

TMH－MM2．0服務(wù)器對綿羊FGF5蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測結(jié)果如圖4所示，顯示存在2個(gè)跨膜區(qū)，表明綿羊FGF5編碼蛋白是跨膜蛋白。

圖4 TMHMM 2．0服務(wù)器對綿羊FGF5蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測Fig．4Prediction of transmembrane domains（arrows indicated）of FGF5protein by using TMHMM 2．0server

2．6 FGF5蛋白的信號肽分析

經(jīng)SignalP 3．0預(yù)測FGF5蛋白的信號肽序列，結(jié)果見圖5。由圖5可知，綿羊FGF5蛋白前20個(gè)氨基酸組成一段信號肽，信號肽裂解點(diǎn)位于第20位氨基酸Ala與第21位氨基酸Gln之間。

圖5 綿羊FGF5蛋白的信號肽分析Fig．5Analysis of the signal peptide in sheep FGF5

2．7 綿羊FGF5蛋白的細(xì)胞定位分析

利用TargetP 1．1和PSORTⅡprediction分析綿羊FGF5蛋白的細(xì)胞定位，結(jié)果（表1）表明，綿羊FGF5蛋白主要集中在分泌途徑上，線粒體中很少，說明該蛋白應(yīng)屬于分泌型蛋白。綿羊FGF5蛋白主要分布在細(xì)胞內(nèi)部，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體，只有少數(shù)分布在細(xì)胞外。

表1 綿羊FGF5蛋白亞細(xì)胞定位分析Tab．1Predicts the subcellular location of sheep FGF5

2．8 FGF5蛋白的二級結(jié)構(gòu)

預(yù)測FGF5蛋白的二級結(jié)構(gòu)由270個(gè)氨基酸組成，其中70個(gè)氨基酸（占25．93%）可能形成α螺旋（藍(lán)色），23個(gè)氨基酸（8．52%）可能形成延伸鏈（紅色），177個(gè)氨基酸（占65．56%）可能形成無規(guī)卷曲（紫色），沒有形成β折疊片。由此可知該蛋白質(zhì)主要以α螺旋及無規(guī)則卷曲為主。

圖6 FGF5蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig．6secondary structure prediction of the FGF5protein

2．9 綿羊FGF5蛋白抗原表位

抗原表位是指能與抗體特異性結(jié)合的、位于抗原分子表面具有特殊結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團(tuán)，也稱為抗原決定簇。杰弗森－沃夫（Jameson－Wolf）抗原指數(shù)是GeneRunner軟件聯(lián)合運(yùn)用 Hoop－Woods、Karplus、Emini、Chou－Fasman和 Robson－Garnier方法，結(jié)合表面概率、鏈柔韌性、親水性及二級結(jié)構(gòu)的信息，預(yù)測蛋白的抗原表位。綿羊FGF5蛋白的抗原表位預(yù)測結(jié)果見圖7。

用DNAMAN軟件對FGF5蛋白的氨基酸序列中潛在的抗原表位作進(jìn)一步分析，顯示有11個(gè)潛在抗原表位（表2）。

圖7 FGF5蛋白的抗原表位分析Fig．7Analysis of the antigenic index of FGF5protein

表2 FGF5氨基酸序列中11個(gè)潛在抗原表位Tab．2 11potential epitopes of amino acid sequence of FGF5

3 討論

生物信息學(xué)作為近年來發(fā)展迅速的一門生物學(xué)科，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能以及確定蛋白質(zhì)生物學(xué)特性等研究領(lǐng)域。本文通過運(yùn)用蛋白在線分析工具及軟件等生物信息學(xué)手段根據(jù)綿羊FGF5基因序列預(yù)測蛋白質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)［8］和抗原表位［9］。研究發(fā)現(xiàn)綿羊FGF5基因CDS序列全長為813bp，編碼蛋白由270個(gè)氨基酸組成，前面20位氨基酸序列是一段信號肽，這與高愛琴等［10］對山羊FGF5蛋白的分析相似，這也是FGF家族的共同特性，說明FGF5蛋白的N末端具有典型的信號序列分泌蛋白，其通過信號肽引導(dǎo)從蛋白合成部位移到細(xì)胞膜壁，最后分泌到胞外。以此推測FGF5基因是以旁分泌形式作用于靶細(xì)胞。

預(yù)測蛋白序列中跨膜螺旋的位置是當(dāng)前生物信息學(xué)中重要的研究課題，因?yàn)橥ㄟ^對膜蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測能為該蛋白的功能研究提供重要線索。分析發(fā)現(xiàn)綿羊FGF5基因編碼蛋白存在2個(gè)可能的跨膜區(qū)，這就為配體的特異性結(jié)合提供了受體的分子基礎(chǔ)，其具體生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。通常，轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域決定蛋白質(zhì)的功能，轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)是比較松散的結(jié)構(gòu)，易于發(fā)生扭曲、盤旋并展示在蛋白的表面，該區(qū)域常含B細(xì)胞的優(yōu)勢抗原表位［11］。綿羊FGF5蛋白二級結(jié)構(gòu)分析顯示以α螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主，指示該蛋白屬混合型蛋白［12］，該區(qū)域抗原指數(shù)較高，該區(qū)段的抗原表位應(yīng)該是優(yōu)勢抗原表位所在，通過DNAMAN軟件分析我們得知該蛋白具有11個(gè)抗原表位。而抗原表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，我們可以根據(jù)分析結(jié)果正確詳細(xì)地繪制蛋白質(zhì)抗原表位的圖譜，為下一步研究抗體可變區(qū)的功能、提高抗體的親和力、設(shè)計(jì)抗原和抗體提供理論基礎(chǔ)。

目前對FGF5蛋白的結(jié)構(gòu)研究還比較少，本實(shí)驗(yàn)在成功克隆FGF5基因CDS片段的基礎(chǔ)上，對綿羊FGF5蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)、信號態(tài)、跨膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)以及抗原表位等進(jìn)行了預(yù)測分析，這就為進(jìn)一步闡明FGF5基因在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制提供了線索。

［1］Pennycuik P R，Raphael K A．The angora locus（go）in the mouse：hair morphology，duration of growth cycle and site of action［J］．J Clin Invest，1999，104（7）：855－864．

［2］Hebert J M，Rosenquist T，Gotz J．FGF5as a regulator of the hair growth cycle：evidence from targeted and spontaneous mutations［J］．Cell，1994，78：1017－1025．

［3］Suzuki S，Kato T，Takimoto H．Localization of rat FGF5 protein in skin macrophage－like cells and FGF5Sprotein in hair follicle：possible involvement of two FGF5gene products in hair grotwh cycle regulation［J］．J Invest Dermatol，1998，111（6）：963－972．

［4］Ito C，Saitoh Y，F(xiàn)ujita Y．Decapeptide with fibroblast growth factor（FGF）－5partial sequence inhibits hair growth suppressing activity of FGF5［J］．J Cell Physiol，2003，197（2）：272－283．

［5］Suzuki S，Ota Y，Ozawa K．Dual－mode regulation of hair growth cycle by two FGF5gene products［J］．J Invest Dermatol，2000，114（3）：456－463．

［6］高愛琴，李寧，趙興波，等．不同綿羊品種FGF5基因的多態(tài)性分析［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（4）：326－330．

［7］Pennycuik P R，Raphael K A．The angora locus（go）in the mouse：hair morphology，duration of growth cycle and site of action［J］．Journal of Clinical Investigation，1999，104（7）：855－864．

［8］郝柏林，張淑譽(yù)．生物信息學(xué)手冊［M］．上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2002：250－256．

［9］Korber B，LaBute M，Yusim K．Immunoinformatics comes of age［J］．Plos Computational Biology，2006，2（6）：484－92．

［10］高愛琴，李 寧，李金泉，等．山羊FGF5基因cDNA分子克隆及序列分析［J］．內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（2）：180－184．

［11］Blythe M，F(xiàn)lower D．Benchmarking B cell epitope prediction：underperformance of existing methods［J］．Protein Sci，2005，14：1246－1248．

［12］Skolnick J，F(xiàn)etrow J S．From genes to protein structure and function：novel applications of computational approaches in the genomic era［J］．Trends in Biotechnology，2000，18（1）：34－39．