高產(chǎn)腈水解酶Alcaligenes faecalis UL44菌株的誘變篩選

徐建明，柳志強，徐建妙，張金峰，鄭裕國

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310014)

草甘膦是一種安全的滅生性除草劑，具有廣譜、低毒和無殘留的特點。隨著轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物的發(fā)展，全球草甘膦的使用面積正以每年20%的速度遞增，成為具有典型代表性的農(nóng)藥產(chǎn)品［1］。我國草甘膦的生產(chǎn)工藝主要分為甘氨酸法［2-3］和二乙醇胺-亞氨基二乙酸(Iminodiacetic acid，簡稱IDA)法［4］。目前國際的主流路線則是IDA法，而亞氨基二乙酸的生產(chǎn)都是采用化學(xué)法生產(chǎn)，生產(chǎn)過程采用劇毒的氫氰酸，污染嚴重、成本高［5］，利用微生物酶法生產(chǎn)亞氨基二乙酸具有反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染少等特點［6］，但其面臨的主要問題是腈水解酶酶活不高，需通過菌種改良的方法得到具有較高腈水解酶酶活的菌株。亞氨基二乙酸為白色結(jié)晶粉末或白色斜方晶體，無毒，是一種重要的化工中間體。其用途廣泛，主要應(yīng)用于合成農(nóng)藥草甘膦。IDA具有很強的絡(luò)合能力，能和多種金屬離子絡(luò)合而形成螯合物，同時分子中又含有亞氨基和羧基，化學(xué)性質(zhì)活潑應(yīng)用廣泛［7-8］。離子注入誘變微生物的應(yīng)用是近些年來發(fā)展較快的一種輻射誘變技術(shù)［9］，它和其他常規(guī)的輻射誘變及化學(xué)誘變有著明顯的差異，其他輻射誘變僅僅是利用能量交換，化學(xué)誘變是利用分子基團的交換，而離子注入誘變集物理輻射誘變和化學(xué)誘變于一體，因此，離子注入誘變打破了傳統(tǒng)誘變方法中多次誘變導(dǎo)致的負突變和抗性飽和。本研究對本實驗室從土壤中篩選得到的腈水解酶產(chǎn)生菌Alcaligenes faecalis ZJB09133進行了紫外線和低能離子束誘變，最終選育得到4株可穩(wěn)定遺傳的正突變菌株，酶活最高的菌株UL44較原始菌株在腈水解酶酶活上提高了124.5%。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株原始菌株為Alcaligenes faecalis ZJB09133，由本實驗室從土壤中篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件①斜面培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5，NaCl 10，蛋白胨10，瓊脂20，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，置于30℃，培養(yǎng)24 h;②誘變培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5，NaCl 10，蛋白胨10，瓊脂20，LiCl 5，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，置于30℃，培養(yǎng)48 h;③種子培養(yǎng)基(g/L)：醋酸銨7，甘露醇2.5，NaCl 1，酵母膏4，K2HPO45，MgSO40.2，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，正丁腈0.3%(誘導(dǎo)劑，在接種時加入)，溫度為30℃，培養(yǎng)24 h;④發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：醋酸銨7，甘露醇2.5，NaCl 1，酵母膏4，K2HPO45，MgSO40.2，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，正丁腈0.4%(誘導(dǎo)劑，在接種時加入)，溫度為30℃，培養(yǎng)38 h。

1.1.3 主要試劑和設(shè)備亞氨基二乙腈，亞氨基二乙酸，Alfa Aesar購得;酵母膏、蛋白胨、醋酸銨、磷酸氫二鉀等均為市售分析純;液相色譜儀LC-10AS，日本島津;往復(fù)式水浴搖床ZHWY-110X30，上海智城分析儀器制造有限公司;IBBe-Device等離子注入儀，中國科學(xué)院等離子體物理研究所。

1.2 方法

1.2.1 紫外-氯化鋰復(fù)合誘變誘變處理時先打開紫外燈，預(yù)熱20 min，以穩(wěn)定波長。吸取1 mL對數(shù)生長期的種子液，加入到裝有9 mL無菌水的試管中，梯度稀釋至一定濃度。吸取0.1 mL菌懸液均勻地涂布在LB培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放入紫外誘變箱中，打開培養(yǎng)皿蓋，采用功率15 W紫外燈，照射距離30 cm，對菌懸液進行不同時間的誘變處理。將培養(yǎng)皿置30℃恒溫箱避光培養(yǎng)2 d(誘變過程均應(yīng)在無光或者紅光下操作，以避免光復(fù)活現(xiàn)象的發(fā)生影響誘變效果)。進行菌落記數(shù)，按下式計算致死率：

1.2.2 低能離子束誘變［10-11］吸取1 mL對數(shù)生長期的種子液，加入到裝有9 mL無菌水的試管中，吸取0.1 mL菌液均勻的涂布在無菌培養(yǎng)皿上，于超凈工作臺中自然干燥，用氮離子(N+)照射處理。誘變后用1 mL無菌水洗滌平皿，吸取0.1 mL誘變后菌液涂布于平板上培養(yǎng)。30℃恒溫箱培養(yǎng)2 d。進行菌落記數(shù)，計算致死率。

1.2.3 誘變菌株篩選從誘變后的平板挑取單菌落于斜面培養(yǎng)基中，30℃恒溫箱培養(yǎng)，24 h后挑取1環(huán)接種于種子培養(yǎng)基。24 h后取5 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵38 h進行酶活檢測。計算正突變率。取酶活最高的菌株為目標菌株。圖1為誘變選育的流程。

圖1 誘變選育流程圖Fig.1 Schematic drawing of mutation and screening process

1.2.4 遺傳穩(wěn)定性的測定選取試驗中酶活最高的誘變菌株，連續(xù)傳代5代，測定每一代腈水解酶酶活，比較其變化。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)化取0.2 g搖床培養(yǎng)38 h的發(fā)酵液離心得到的菌體，用10 mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖液制成菌懸液。加入底物亞氨基二乙腈，35℃水浴搖床反應(yīng)6 h，取1 mL反應(yīng)液離心，取上清液HPLC分析。

1.2.6 酶活定義35℃條件下，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物得到1 μmol亞氨基二乙酸所需要的酶量定義為1個酶活單位U。

1.2.7 分析方法產(chǎn)物測定：Sil-20A型高效液相色譜儀，色譜柱為Hypersil SAX 5(4.6 mm×250 mm ID);流動相為濃度20 mmol/L的磷酸氫二銨緩沖液(磷酸調(diào)pH至4.0)，柱溫為30℃;檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210 nm，以峰面積外標法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生長曲線的繪制

ZJB09133生長曲線見圖2。由圖2可知，菌體在16 h進入對數(shù)生長期，32 h后進入穩(wěn)定期。根據(jù)曲線，選擇培養(yǎng)24～28 h的菌體進行誘變。

圖2 ZJB09133菌體生長曲線Fig.2 Growth curve of ZJB09133

2.2 紫外-氯化鋰復(fù)合誘變

圖3 紫外-氯化鋰誘變致死曲線Fig.3 Lethality curve of UV-LiCl mutation

紫外線(UV)的誘變機理是其能引起DNA結(jié)構(gòu)變化。DNA分子強烈地吸收紫外線、可引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內(nèi)部和分子間的交聯(lián)、核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、嘧啶水合作用以及形成嘧啶二聚體。本研究對菌體分別照射5、10、15、20、25、30 s，計算致死率，得到誘變劑量與致死率的關(guān)系，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著紫外線照射時間的延長，致死率也增大，當照射時間為高于30 s時，致死率高于99%，根據(jù)微生物育種研究經(jīng)驗可認為致死率以90.0%～99.9%效果較好，但也有報道認為較低的致死率有利于正突變菌株的產(chǎn)生，而較高的致死率往往導(dǎo)致負突變率的提高［12］。在本研究中當照射時間為15 s時，其正突變率是最高的，達到20%，此時致死率在80%左右。所以選擇15 s作為誘變的劑量。

2.3 低能離子束誘變

2.3.1 注入劑量與菌落存活數(shù)關(guān)系離子束對生物體有能量沉積和質(zhì)量沉積雙重作用，從而使生物體產(chǎn)生死亡、自由基間接損傷、染色體重復(fù)、易位、倒位或使DNA分子斷裂、堿基缺失等多種生物學(xué)效應(yīng)。氮離子注入量30×2.3×1013、60×2.3×1013、90×2.3×1013、120×2.3×1013、150×2.3×1013ions/cm2，注入能量15 kev，靶室真空度10－3Pa，脈沖注入，繪制劑量與存活量關(guān)系圖。

如圖4所示，糞產(chǎn)堿桿菌細胞隨著N離子注入劑量的增加，菌種的存活數(shù)先減小后增大，然后又變小，形成典型的“馬鞍型”劑量-效應(yīng)曲線［13］。這種特有的“馬鞍型”變化被認為是能量、動量作用下的損傷效應(yīng)和質(zhì)量、電荷作用下的保護和刺激效應(yīng)綜合作用的結(jié)果［14-15］。

圖4 注入劑量與菌落存活數(shù)(CFU)的關(guān)系Fig.4 The relationship between implantation dosage and amount of colonies surviving

2.3.2 各注入劑量的正負突變率通過每個劑量各挑取50株菌株，計算其正負突變率，結(jié)果如圖5所示，當劑量為60×2.3×1013ions/cm2其誘變的正突變率最高，達到22%。

圖5 不同注入劑量的正負突變率Fig.5 The positive，negative mutation rate of different implantation dosage

2.4 遺傳穩(wěn)定性的研究

經(jīng)單獨、復(fù)合多次誘變，通過篩選從500株誘變株中選取4株酶活最高菌株，分別命名為D121、D132、UL44、UL152，連續(xù)5次傳代培養(yǎng)，以測定其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。以相對于未傳代誘變菌株的酶活變化率作為評價指標。4株菌株酶活變化幅度較小，證明該菌株的遺傳性能穩(wěn)定。

表1 高產(chǎn)菌株傳代穩(wěn)定性的研究Table 1 The assessments of genetic stability

3 結(jié)論

現(xiàn)代微生物誘變育種理論認為，當誘變的微生物致死率在70%～75%左右時，產(chǎn)量性狀的正突變率往往很高，而更高的致死率下，雖然突變率較高，而正突變率卻很低。在本研究中取得了與上述結(jié)論相似的結(jié)果。當紫外照射時長為15 s時，也就是致死率大約為80%的時候，正突變率是最高的，達到20%。以Alcaligenes faecalis ZJB09133為出發(fā)菌株，采用UV-LiCl，離子注入進行誘變處理，當紫外照射時間和離子注入量分別為15 s和60×2.3×1013ions/cm2時，正突變是最高，分別達到20%和22%。

在挑取的所有菌落中，最終得到了4株腈水解酶酶活較高的菌株，且經(jīng)過連續(xù)5代的傳代培養(yǎng)，酶活沒有明顯的下降，其中UL44酶活是最高的，達到74.6 U/g，比初始菌株酶活提高124.5%。

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