• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酸菜中降膽固醇功能植物乳桿菌的體外篩選

    2011-01-09 05:11:20于志會李常營張雪李盛鈺李達楊貞耐
    食品與生物技術學報 2011年3期
    關鍵詞:膽鹽活菌益生菌

    于志會, 李常營, 張雪, 李盛鈺, 李達, 楊貞耐*1,

    (1.吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院,吉林長春 130118;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,吉林長春 130033;3.吉林農(nóng)業(yè)科技學院,吉林 132011)

    酸菜中降膽固醇功能植物乳桿菌的體外篩選

    于志會1,3, 李常營2, 張雪2, 李盛鈺2, 李達2, 楊貞耐*1,2

    (1.吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院,吉林長春 130118;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,吉林長春 130033;3.吉林農(nóng)業(yè)科技學院,吉林 132011)

    以分離自東北家庭自制酸菜中的9株植物乳桿菌為研究對象,采用鄰苯二甲醛法篩選具有降膽固醇功能的乳桿菌,并通過耐酸、耐膽鹽及抗生素敏感性實驗,分析菌株的益生特性。結果表明,多株植物乳桿菌具有良好的降膽固醇功能,其中菌株S56的脫除膽固醇的量最高,達到22.40μg/m L。實驗菌株均能耐受p H 3.0的酸度和10 g/L的牛膽鹽。其中菌株S2-6、S2-5、S4-1和S56在p H 2.0的環(huán)境中能保持生長1 h,具有較強的耐酸性。

    植物乳桿菌;膽固醇降解;體外篩選

    血清膽固醇水平偏高是誘發(fā)動脈硬化、冠心病、腦中風等心腦血管疾病的主要危險因素,嚴重威脅著人類的健康。20世紀70年代,科學家先后通過對大量飲用酸乳等發(fā)酵乳制品的非洲Masai人血清膽固醇的研究和對常飲酸乳的美國人的調(diào)查均發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有降低人體血清膽固醇的作用[1]。這些結果引起了國內(nèi)外研究者的普遍關注。近年來人們對嗜酸乳桿菌降膽固醇功能進行了大量的研究工作。Danieloson等報導了由豬腸道中分離出的嗜酸乳桿菌LA 16能降低豬血清膽固醇和低密度脂蛋白[2]。Corzo和 Gilliland等研究表明嗜酸乳桿菌能分泌膽鹽水解酶促進甘氨酸和牛磺酸水解,形成的游離膽酸和膽酸鹽進而與膽固醇發(fā)生共沉淀作用[3];另外一些研究發(fā)現(xiàn)其它乳桿菌如發(fā)酵乳桿菌[4]、加氏乳桿菌[5]、雙歧桿菌[6]和干酪乳桿菌[7]等也具有良好的體外降膽固醇功能。但目前關于植物乳桿菌降膽固醇的研究報道甚少[8]。

    一些傳統(tǒng)發(fā)酵食品是功能性益生菌的重要來源。為了篩選具有降低膽固醇功能的益生性乳桿菌,本研究利用體外篩選方法分析了9株分離自東北家庭自制酸菜的植物乳桿菌(L.p lantarum)的降膽固醇作用,并對其耐酸、耐膽鹽、抗生素敏感性等益生特性進行研究。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

    供試菌株分離自東北家庭自制酸菜,為作者所在實驗室保藏菌株。經(jīng)表型、生理生化、API試驗和16srDNA鑒定均為植物乳桿菌。陽性對照的益生菌株為Lactobacillus rham nosusGG(LGG),分離自市售LGG發(fā)酵乳(伊利乳業(yè)集團)。菌株在含體積分數(shù)30%甘油的MRS培養(yǎng)基中,-80℃凍存。使用前接種于MRS液體培養(yǎng)基,37℃活化2次。

    培養(yǎng)基:M RS液體培養(yǎng)基和M RS固體培養(yǎng)基按文獻方法配制[9]。MRS-Oxgall-CHOL液體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基中加入已過濾除菌的水溶性膽固醇(100μg/m L)、膽鹽(3 g/L)、巰基乙醇酸鈉(體積分數(shù)0.2%)。

    1.2 主要儀器和試劑

    BCN-1360B型無菌超凈工作臺:哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司生產(chǎn);GENbox厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)(bioMérieux),Cary 300 UV-V IS分光光度計:美國Varian公司生產(chǎn);Thermo CR3i高速冷凍離心機:美國 Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn);氮吹儀:上海濟成分析儀器有限公司生產(chǎn);水溶性膽固醇、牛膽鹽、巰基乙醇酸鈉均購自美國Sigma公司;多種抗生素:北京鼎國生物技術有限責任公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 降膽固醇植物乳桿菌的體外篩選

    1)活化菌株:菌液中菌的濃度為3×109CFU

    /m L按體積分數(shù)3%接種量接入10 m L滅菌MRSO-Oxgall-CHOL液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)24 h,離心(10 000 g,4 ℃,10 min),取上清。采用鄰苯二甲醛法[10]測定所得上清液膽固醇的含量,以未接菌的M RSO-Oxgall-CHOL培養(yǎng)液作空白對照,對照液的膽固醇含量減去培養(yǎng)液上清膽固醇含量,即得到被測菌體去除的膽固醇量。所得OD值依據(jù)膽固醇標準曲線計算出膽固醇移除量。

    1.3.2 耐酸試驗 用1 mol/L鹽酸調(diào)M RS液體培養(yǎng)基到p H值分別為2.0、3.0。菌種活化培養(yǎng)24 h后,按照體積分數(shù)3%的接種量加到p H值為2.0、3.0的液體M RS中,置于37 ℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng),分別于1、2和3 h無菌取出培養(yǎng)菌液50μL,稀釋并涂布于M RS瓊脂平板中[11]。37℃厭氧培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)(以CFU/m L表示)。

    1.3.3 菌株耐膽鹽能力測試 試驗設3、5、10 g/L 3個膽鹽質(zhì)量濃度,以不加膽鹽的培養(yǎng)基為對照?;罨蟮娜闂U菌接種于M RS液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)24 h,按體積分數(shù)3%接種量分別接種于含不同濃度牛膽鹽的M RS液體培養(yǎng)基中。37℃厭氧培養(yǎng),分別于0 h和4 h無菌取出培養(yǎng)液50μL,稀釋并涂布于M RS瓊脂平板中。培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)。

    1.3.4 藥物敏感性試驗 采用最小抑制濃度值法(M IC)[12]。依據(jù)各類抗生素作用機制不同,選擇了抑制細菌細胞壁合成、細菌核酸合成和蛋白質(zhì)合成以及抑制細胞質(zhì)膜的10種常用抗生素。上述10種抗菌藥物根據(jù)不同劑型和不同的溶劑進行倍比稀釋 ,終質(zhì)量濃度為:512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg/L。M RS液體培養(yǎng)基添加不同濃度的抗生素,37℃厭氧培養(yǎng)24 h。根據(jù)生長狀況觀察得出菌株對每種抗生素的M IC值。根據(jù)測定的M IC值和M IC臨界點值EUC(EU Commission)的統(tǒng)計參考值,確定菌株對各種抗生素的敏感性結果。

    2 結果與分析

    2.1 降膽固醇菌株的體外篩選

    9株植物乳桿菌及1株商業(yè)菌(L.rham nosusGG)厭氧條件下在M RS-Oxgall-CHOL液體培養(yǎng)基中膽固醇的去除能力如圖1所示,實驗菌株均具有較好的膽固醇去除能力,去除量在14.38~22.40 μg/mL。試驗菌株中除SC9膽固醇脫除量(14.38 μg/mL)略低于商業(yè)菌L.rhamnosusGG(14.84 μg/mL)以外,其余均有較強的脫除能力。其中S56的脫除膽固醇的量最高,達到22.40μg/m L。

    圖1 乳桿菌對膽固醇的脫除能力Fig.1 Cholesterol removal ability by lactobacilli strains

    2.2 耐酸性

    耐酸試驗結果見表1,雖然不同菌株起始活菌數(shù)不同(lg CFU/mL從7.7~8.7),但9株受試菌在p H值3.0、37 ℃條件下培養(yǎng)3 h后,除S38以外活菌數(shù)均超過6.7 lg CFU/m L,菌株的存活率在85%以上。這可能與其在酸菜的高酸度環(huán)境條件下長期馴化有關,從而對酸具有天然的抵抗能力。菌株S2-6、S4-1、S56和 S72的酸耐受能力與陽性對照菌L.rham nosusGG相當。菌株 S2-5、S2-6、S4-1、S56在p H值2.0,37 ℃條件下培養(yǎng)1 h后,活菌數(shù)分別為 5.6、5.8、6.0和 6.1 lg CFU/mL。均高出L.rham nosusGG的活菌數(shù)(4.5 lg CFU/mL),說明4株植物乳桿菌具有較強的低p H耐受性能。菌株 S38在p H 2.0,37℃條件下培養(yǎng)1h后,活菌數(shù)為4.0 lg CFU/m L,耐酸能力相對低一些。另外4株菌 SC2、SC9、S72、S52雖在p H值為3.0條件下具有較強的耐酸性,但均不能耐受p H值為2.0。

    表1 植物乳桿菌的耐酸性能Tab.1 Acid resistance of Lactobacillus plantarum活菌數(shù)/(lg CFU/mL)

    2.3 菌株耐膽鹽能力測試

    供試菌株在含質(zhì)量濃度分別為3、5、10 g/L的牛膽鹽培養(yǎng)基中,生長狀況良好,膽鹽耐受能力與陽性對照菌株L.rham nosusGG相當。如表2所示。

    表2 植物乳桿菌的耐膽鹽情況Tab.2 Bile tolerance of Lactobacillus plantarum活菌數(shù)/(lg CFU/m L)

    試驗結果表明,9株植物乳桿菌在不同程度上對高質(zhì)量濃度牛膽鹽(10 g/L)均有耐受性,活菌數(shù)在7.4 lg CFU/m L以上,菌株存活率在87%以上,且這些菌株均隨著膽鹽濃度的增加,活菌數(shù)具有不同程度的降低。與對照菌L.rham nosusGG結果一致。菌株S72在膽鹽質(zhì)量濃度5 g/L的條件下的活菌數(shù)比在膽鹽質(zhì)量濃度為 3 g/L時略高。在P.Burns、G. Vinderola等人的研究報道中,L.p lantarum08342和L.plantarum20174在膽鹽質(zhì)量濃度5 g/L的條件下的生長情況也略好于膽鹽質(zhì)量濃度為3 g/L的生長情況[13]。這表明適當?shù)哪扄}濃度(如5 g/L)可能刺激某些植物乳桿菌的生長??傊?本研究的9株植物乳桿菌均具有較強的耐膽鹽能力。

    2.4 抗生素敏感性試驗

    按照1.3.4中所述方法對供試菌株進行藥物敏感性試驗,根據(jù) E-Test結果判讀手冊讀取實驗結果,見表3。

    在檢測的9株植物乳桿菌中,菌種不同對抗生素的最小抑制濃度也不同。所有菌株均耐受4種或4種以上的抗生素,屬于多重耐藥菌。尤其是對卡那霉素、萬古霉素、多粘菌素B、赤霉素等4種抗生素均表現(xiàn)出強耐藥性,最小抑制質(zhì)量濃度均高于512μg/m L。所有菌株對紅霉素、利福平、氯霉素、青霉素等4種抗生素敏感,這也與選擇的商業(yè)菌株L.rhamnosusGG結果一致。Sw enson[14]等研究證實許多乳桿菌對糖肽類抗生素-萬古霉素具有耐藥性,Kattla[15]等研究證實乳桿菌對四環(huán)素和氯霉素敏感,本實驗也得出了相同的實驗結果。

    表3 實驗菌株對不同抗生素的最低抑菌質(zhì)量濃度(M IC)Tab.3 Strains minimum inhibitory concentration of different antibiotics(M IC) M IC/(μg/m L)

    3 討論與結語

    益生菌是指通過攝取適當?shù)牧?對食用者的身體健康能發(fā)揮有效作用的活菌[16]。益生菌在激活機體的免疫系統(tǒng)[17]、緩解腸道炎癥[18]、降低膽固醇[19]和降血壓[20]等方面發(fā)揮重要作用。目前功能益生菌正受到越來越多的關注,篩選這些功能益生菌成為研究熱點。尤其是一些長期食用安全的傳統(tǒng)發(fā)酵食品,是功能性益生菌的重要來源[21]。本研究采用體外篩選方法從東北酸菜品來源的乳桿菌中篩選出多株具有降膽固醇功能植物乳桿菌,并有望為今后益生菌和功能性乳制品的研究與開發(fā)提供優(yōu)良菌種。

    經(jīng)口進入機體的益生菌,必須能耐受上消化道的強酸和高膽鹽環(huán)境,并具有良好的粘附性能及定植抗性才能發(fā)揮益生作用。因此,對于具有特定功能的降膽固醇功能的乳桿菌必須能夠耐受低p H值的胃液及腸內(nèi)的高膽鹽環(huán)境才能發(fā)揮其功能性。Pereira等評價了一些分離自人腸道的乳桿菌和雙歧桿菌的體外降膽固醇作用,同時考察了菌株對低p H值和膽鹽的耐受能力[22]。T.D.T.nguyen等報道了從新生嬰兒糞便中分離的植物乳桿菌p H 04在動物體內(nèi)降膽固醇能力及膽鹽耐受性和抗生素敏感性[23]。本研究對篩選出的9株具有較強降膽固醇功能的植物乳桿菌的耐酸及耐膽鹽能力進行了分析。結果表明實驗菌株均能耐受p H值為3.0的酸度和10 g/L的牛膽鹽。其中菌株S2-6、S2-5、S4-1和S56在p H值為2.0的低酸環(huán)境中能保持生長1h,具有較強的耐酸性。經(jīng)綜合比較,S56對膽固醇的脫除及耐酸、耐膽鹽能力均較高,在藥物敏感性試驗中對各抗生素也表現(xiàn)出一定敏感性。

    乳酸菌確切的降膽固醇機理尚不明確,可能的降膽固醇機理包括(1)游離膽酸鹽與膽固醇的共沉淀作用;(2)細菌酶對膽酸鹽的去結合作用;(3)膽固醇結合到細菌細胞膜或壁上;(4)細菌對膽固醇的吸收;(5)共沉淀和吸收作用同時發(fā)生。本研究經(jīng)體外篩選獲得了4株具有較強的耐酸、耐膽鹽和降膽固醇等特性的植物乳桿菌,后續(xù)研究有必要將其應用于動物體內(nèi)檢測其對血清等膽固醇的影響情況,并進一步分析其降膽固醇的機制。

    (References):

    [1]Manson JE,Tostesonh,Ridker PM,et.al.The primary prevention of myocardial infarction[J].New Engl JMed,1992,326:1406-1416.

    [2]Danielson A D,E R Peo,Jr K M Shahani,et al.Anticholesterolemic property ofLactobacillus acidophilusyogurt fed to mature boars[J].An im.Sci,1989,67:966-974.

    [3]Corzo G,S E Gilliland,L M Buck.Measurement of bile salt hydrolase activity from Lactobacillus acidophilus based on disappearance of conjugated of bile salts[J].J.Dairy Sci,1999,82:466-471.

    [4]Brashears M M,Gilliland,L M Buck.Bile salt deconjugation and cholesterol removal from media by Lactobacillus casei[J].J.Dairy Sci,1998,81:2103-2110.

    [5]Usman H A.Bile tolerance,taurocholate deconjugation,and binding of cholesterol byLactobacillus gasseristrains[J].J.Dairy Sci,1999,82:243-248.

    [6]Dora IA Pereira,Glenn R Gibson.Cholesterol assimilation by lactic acid bacteria andB ifidobacteriaisolated from the human gut[J].Applied and Environmental M icrobiology,2002,4689-4693.

    [7]M T Liong,N P Shah.Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability ofLactobacilli strains[J].J.Dairy Sci,2005,88:55-66.

    [8]M in Zhang,xiaomin Hang,Xiaobing Fan.Characterization and selection ofLactobacillus strainsfor their effect on bile tolerance,taurocholate deconjugation and cholesterol removal[J].World JM icrobiol Biotechnol,2008,24:7-14.

    [9]De Man JC,Rogosa M,Sharpe M E.A medium for the cultivation of lactobacilli[J].J.Appl.Bacteriol.,1960,23:130-135.

    [10]Gilliland SE,Nelson CR,Maxwell C.A ssimilation of cholesterol byLactobacillus acidophilus[J].Applied and Environmental Microbiology,1985,49(2):377-381.

    [11]Claire,L Vernazza,Glenn R.et al.Carbohydrate.Acid tolerance and bile tolerance in five strains ofB ifidobacterium[J].Journal of Applied Microbiology,2006,100:846-853.

    [12]W PCharteris,PM Klly,L Morelli,et al.Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobacterium isolates from the human gastrointestinal tract[J].Applied Microbiology,1998,26:333-337.

    [13]Burns P,Vinderola G.Bile-resistant derivatives obtained from nonintestinal dairylactobacilli[J].International Dairy Journal,2008,18:377-385.

    [14]Swenson JM,Facklam R R,Tho rnsberry C.Antimicrobial susceptibility of vancomycin resistantLeuconostoc,PediococcusandLactobacillusspecies[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1990,34:543-547.

    [15]Kattla A K,Kruse H Johnsen G,Herikstad H.Antimicrobial susceptibility of starter culture bacteria used in Norwegian dairy products[J].International Journal of Food Microbiology,2001,67:147-152.

    [16]Haenel H,Bendig J.Intestinal flora in health and disease[J].Progr.Food Nutr.Sci.1,1975,21-64.

    [17]Cunningham-Rundles S,Ahrne S,Bengmark S,et.al.Probiotic and immune response[J].The American Journal of Gastroenterology,2000,95(1):S22-S25.

    [18]Isolauri E,Kirjavainen P V,Salminen S.Probiotics:a role in the treatment of intestinal infection and inflammation[J].Gut.50.suppl,2002,3:11154-9.

    [19]Do ra IA,Pereira,Glenn R.Gibson.Cholesterol assimilation bylactic acid bacteriaandbifidobacteriaisolated from the human gut[J].Appl.Environ.Microbio,2002,9:4689-4693.

    [20]Hata Y,Yamamoto M,Ohni M,et al.A placebo-controlled study of the effect of sourmilk on blood pressure in hypertensive subjects[J].Am.J.Clin.Nutr,1996,64:767-771.

    [21]居華,劉書亮,敖靈,王燚.降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及生長特性[J].中國乳品工業(yè),2007,35(8):007-011.

    JU Hua,LIU Shu-liang,AO Ling,et al.Study on characteristics of grow th,screening and identification of cholesterol-reducing Lactic acid bacteria[J].China dairy industry,2007,35(8):007-011.(in Chinese)

    [22]Perira D IA,G R Gibson.Cholesterol assimilation by lactic acid bacteria and bifidobacteria isolated from the human gut[J].Appl.environ.Microbiol,2002,68:4689-4693.

    [23]T D T Nguyen,J H Kang,M S Lee.Charaterization ofLactobacillus plantarumPh04,a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects[J].Inter Journal of Food M icrobiology,2007,113:358-361.

    In Vitro Cholesterol-Lowering Activity of Potential Probiotic Lactobacillus Plantarum Isolated from Chinese Sauerkraut

    YU Zhi-hui1.3, LI Chang-ying2, ZHANG Xue2, L ISheng-yu2, LI Da2, YANG Zhen-nai*1,2
    (1.College of Biological and Agricultural Engineering,Jilin University,Changchun 130118,China;2.Center of Agro-Food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China;3.Jilin Agriculture Science and Technology College,Jilin,132011,China)

    NineLactobacillus plantarumstrains were isolated from the Northeast homemade sauerkraut and exhibited high cholestero l-lowering ability.By acid and bile tolerance and antimicrobial susceptibility testing,these strains were studied for their potenticl probiotic.The results showed good cholesterol-lowering ability with S56 giving the highest of cholesterol removal at 22.40μg/mL.A ll the strains could tolerate pH 3.0 and 10 g/L of bovine bile salt.Strains S2-6,S2-5,S4-1 and S56 maintained the grow th for 1h at pH 2.0.

    L actobacillus plantarum,cholesterol lowering,in vitro screening

    TQ 920.1

    A

    1673-1689(2011)03-0398-05

    2010-05-22

    國家自然科學基金項目(No.30670057)。

    于志會(1979-),女,吉林農(nóng)安人,博士研究生,講師,主要從事生物資源保護與利用研究。

    Email:yzh_jilin@163.com

    楊貞耐(1965-),男,江西廣豐人,工學博士,研究員,主要從事乳品工藝與生物技術研究。Email:zyang@cjaas.com

    猜你喜歡
    膽鹽活菌益生菌
    乳桿菌在膽鹽 MRS 培養(yǎng)基中的傳代穩(wěn)定性
    Ligilactobacillus sp.BD7642關鍵膽鹽水解酶的發(fā)掘
    運用OD值法快速進行乳酸菌活菌計數(shù)的研究
    提高乳酸菌耐膽鹽能力的研究
    生物化工(2020年3期)2020-01-07 23:51:31
    益生元和益生菌促進豬生長和健康
    益生菌別貪多
    幸福(2017年18期)2018-01-03 06:34:45
    神奇的小小腸道益生菌
    中國益生菌網(wǎng)
    雙歧三聯(lián)活菌聯(lián)合硝苯地平治療腹瀉型腸易激綜合征的臨床效果
    雙歧桿菌三聯(lián)活菌聯(lián)合多潘立酮治療新生兒喂養(yǎng)不耐受40例
    国产成人av教育| 男男h啪啪无遮挡| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜免费成人在线视频| 精品国产美女av久久久久小说| 俄罗斯特黄特色一大片| 成年人黄色毛片网站| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 在线永久观看黄色视频| 亚洲九九香蕉| 可以在线观看的亚洲视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲国产精品sss在线观看| a级毛片a级免费在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品久久久久久久久久久久久 | 久久久久久九九精品二区国产 | 欧美乱妇无乱码| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲色图av天堂| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美日韩一级在线毛片| 级片在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美激情高清一区二区三区| 99热6这里只有精品| 窝窝影院91人妻| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 在线观看舔阴道视频| 91字幕亚洲| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精华一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av成人一区二区三| 久久欧美精品欧美久久欧美| 变态另类丝袜制服| 后天国语完整版免费观看| 日本一本二区三区精品| 亚洲三区欧美一区| 久久天堂一区二区三区四区| 色精品久久人妻99蜜桃| 成熟少妇高潮喷水视频| 不卡av一区二区三区| 美女免费视频网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美中文日本在线观看视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产男靠女视频免费网站| a级毛片a级免费在线| 三级毛片av免费| 午夜日韩欧美国产| 日韩精品青青久久久久久| 国产一区二区激情短视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 91大片在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 婷婷精品国产亚洲av在线| 午夜影院日韩av| 淫妇啪啪啪对白视频| 热re99久久国产66热| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 在线观看日韩欧美| 老司机午夜福利在线观看视频| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 757午夜福利合集在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产欧美日韩精品亚洲av| АⅤ资源中文在线天堂| 国产av不卡久久| 90打野战视频偷拍视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 一级片免费观看大全| 久久午夜亚洲精品久久| 人人妻人人澡人人看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 高清在线国产一区| 麻豆一二三区av精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 丁香欧美五月| 欧美zozozo另类| 国产精品久久电影中文字幕| 国产黄片美女视频| 一进一出好大好爽视频| 久久午夜亚洲精品久久| 一级毛片高清免费大全| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 黄色视频,在线免费观看| 免费看日本二区| 亚洲一区中文字幕在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜福利在线观看吧| 观看免费一级毛片| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲中文av在线| 99热6这里只有精品| 无限看片的www在线观看| 美女免费视频网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品一区二区三区av网在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 色综合站精品国产| 桃色一区二区三区在线观看| 女性被躁到高潮视频| 国产主播在线观看一区二区| 99riav亚洲国产免费| 我的亚洲天堂| 亚洲全国av大片| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产乱人伦免费视频| 国产一卡二卡三卡精品| 久久香蕉激情| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美日韩黄片免| 成人免费观看视频高清| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | bbb黄色大片| 亚洲av片天天在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美在线一区亚洲| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久久久久免费高清国产稀缺| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久这里只有精品19| 无限看片的www在线观看| 国产高清激情床上av| 久久久久久久精品吃奶| 伦理电影免费视频| 悠悠久久av| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 999精品在线视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 色av中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 免费高清视频大片| 久久这里只有精品19| 757午夜福利合集在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久久久久久久中文| 国产在线观看jvid| 久久精品成人免费网站| 国产激情欧美一区二区| 久久人人精品亚洲av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 制服人妻中文乱码| 亚洲 国产 在线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 最近最新中文字幕大全电影3 | 成年人黄色毛片网站| 精品国产国语对白av| 久久狼人影院| 香蕉国产在线看| 99久久99久久久精品蜜桃| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 在线观看午夜福利视频| 热re99久久国产66热| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久九九热精品免费| 欧美日本视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲精品色激情综合| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲色图av天堂| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲中文av在线| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品av久久久久免费| 亚洲国产精品久久男人天堂| 18禁观看日本| 大型av网站在线播放| 亚洲在线自拍视频| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品 国内视频| 免费观看精品视频网站| 午夜福利高清视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 757午夜福利合集在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 午夜激情福利司机影院| 成人精品一区二区免费| 日韩免费av在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 色av中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜福利在线在线| 久久久久久国产a免费观看| 国产成人av教育| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| av欧美777| 最近最新免费中文字幕在线| 观看免费一级毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲激情在线av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 一本精品99久久精品77| 老司机深夜福利视频在线观看| 免费看a级黄色片| 久久中文字幕一级| 成人亚洲精品av一区二区| 国产视频一区二区在线看| 午夜免费观看网址| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜福利在线在线| 亚洲精华国产精华精| 成人一区二区视频在线观看| 久久精品91蜜桃| 免费电影在线观看免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲美女黄片视频| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 757午夜福利合集在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产欧美日韩一区二区三| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99精品在免费线老司机午夜| www.自偷自拍.com| or卡值多少钱| 国产97色在线日韩免费| 激情在线观看视频在线高清| 在线免费观看的www视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 精华霜和精华液先用哪个| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产激情久久老熟女| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日韩大码丰满熟妇| 欧美一级a爱片免费观看看 | svipshipincom国产片| 免费无遮挡裸体视频| 宅男免费午夜| 国产欧美日韩一区二区精品| 色播在线永久视频| 婷婷六月久久综合丁香| 嫁个100分男人电影在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品国产高清国产av| 国产三级在线视频| 免费看十八禁软件| 国产精品电影一区二区三区| 国产三级在线视频| or卡值多少钱| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美不卡视频在线免费观看 | 淫秽高清视频在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 一级毛片高清免费大全| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 欧美乱色亚洲激情| 欧美在线黄色| 两性夫妻黄色片| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美黑人精品巨大| 俺也久久电影网| 中文字幕最新亚洲高清| 97碰自拍视频| 亚洲精品色激情综合| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产成年人精品一区二区| 午夜激情福利司机影院| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲国产精品999在线| 人成视频在线观看免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品久久久av美女十八| 久久性视频一级片| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费在线观看影片大全网站| 日韩欧美免费精品| 精品久久蜜臀av无| 成年版毛片免费区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲黑人精品在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 大香蕉久久成人网| 中文字幕高清在线视频| 欧美黑人精品巨大| 欧美日韩一级在线毛片| 99国产精品一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久久大精品| 国产精品永久免费网站| 午夜福利高清视频| 欧美日韩乱码在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 妹子高潮喷水视频| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲第一电影网av| av天堂在线播放| 两性夫妻黄色片| 国产精品国产高清国产av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 人人妻人人澡人人看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 天堂动漫精品| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美三级亚洲精品| 男女之事视频高清在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲片人在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 免费一级毛片在线播放高清视频| 99re在线观看精品视频| 69av精品久久久久久| 99国产精品99久久久久| 国产主播在线观看一区二区| 女警被强在线播放| 成年版毛片免费区| 久久国产精品人妻蜜桃| 自线自在国产av| 国产亚洲精品久久久久5区| 精品欧美一区二区三区在线| 老汉色∧v一级毛片| 满18在线观看网站| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 在线观看免费午夜福利视频| 午夜激情av网站| a级毛片a级免费在线| www.精华液| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久亚洲真实| 成人精品一区二区免费| 久久久久久久久久黄片| 婷婷丁香在线五月| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久亚洲真实| 国产激情欧美一区二区| 在线观看一区二区三区| 成人手机av| 男男h啪啪无遮挡| 黄片小视频在线播放| 国产视频内射| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 91av网站免费观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲精品在线美女| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲av电影在线进入| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 又大又爽又粗| netflix在线观看网站| 精华霜和精华液先用哪个| 国产黄色小视频在线观看| 一进一出抽搐动态| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美激情高清一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品久久电影中文字幕| 国产三级在线视频| 香蕉国产在线看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 色哟哟哟哟哟哟| 人成视频在线观看免费观看| 日本一本二区三区精品| av在线播放免费不卡| 最近在线观看免费完整版| 曰老女人黄片| 丝袜美腿诱惑在线| 波多野结衣巨乳人妻| 久久中文看片网| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲成人久久性| 午夜福利在线观看吧| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国内揄拍国产精品人妻在线 | 国产伦一二天堂av在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 大型黄色视频在线免费观看| 午夜免费激情av| av免费在线观看网站| 亚洲av熟女| 久久精品国产综合久久久| 午夜免费观看网址| 久久久国产成人精品二区| 午夜免费成人在线视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 岛国视频午夜一区免费看| 久久久国产成人精品二区| 男人舔女人的私密视频| 色播亚洲综合网| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | a级毛片a级免费在线| 一级毛片女人18水好多| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲五月天丁香| 老司机在亚洲福利影院| 91av网站免费观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久香蕉国产精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 禁无遮挡网站| 久久久久久久久中文| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品在线观看二区| av福利片在线| 欧美成人午夜精品| 夜夜爽天天搞| www日本在线高清视频| 国产av不卡久久| 日本一本二区三区精品| 1024香蕉在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99在线视频只有这里精品首页| 午夜两性在线视频| 俺也久久电影网| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲国产精品成人综合色| 午夜久久久在线观看| 在线看三级毛片| 国产精品免费视频内射| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲最大成人中文| 51午夜福利影视在线观看| 久久精品国产综合久久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产在线精品亚洲第一网站| 黄色女人牲交| 校园春色视频在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 日本一区二区免费在线视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲av熟女| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男人舔女人下体高潮全视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲第一av免费看| www国产在线视频色| 91成人精品电影| 热99re8久久精品国产| 午夜激情av网站| 免费看美女性在线毛片视频| 一级毛片精品| 亚洲男人天堂网一区| 久久伊人香网站| 99re在线观看精品视频| 亚洲第一电影网av| 国产三级在线视频| 三级毛片av免费| 欧美一区二区精品小视频在线| 天天添夜夜摸| 不卡av一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩欧美国产在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成人国语在线视频| 亚洲美女黄片视频| 国产激情久久老熟女| 搡老岳熟女国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品电影一区二区在线| 后天国语完整版免费观看| 国产一区二区三区视频了| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 婷婷亚洲欧美| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| a在线观看视频网站| 欧美成人午夜精品| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品免费视频内射| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 成年人黄色毛片网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 人成视频在线观看免费观看| 国产视频一区二区在线看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 99国产精品一区二区蜜桃av| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩高清综合在线| 超碰成人久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久性视频一级片| 成人av一区二区三区在线看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品电影一区二区在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲真实伦在线观看| 成年免费大片在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 岛国视频午夜一区免费看| 淫妇啪啪啪对白视频| 99在线人妻在线中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 日韩欧美免费精品| 亚洲最大成人中文| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黑人操中国人逼视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 岛国在线观看网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 一级黄色大片毛片| 99精品久久久久人妻精品| 成人av一区二区三区在线看| 中文字幕人妻熟女乱码| 大型黄色视频在线免费观看| 可以在线观看的亚洲视频| 大型黄色视频在线免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 一区二区三区激情视频| 一区二区三区精品91| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人手机av| 精品人妻1区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 特大巨黑吊av在线直播 | 精品欧美一区二区三区在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 一级a爱视频在线免费观看| 香蕉国产在线看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美精品亚洲一区二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 青草久久国产| 亚洲成人久久性| 精品一区二区三区四区五区乱码| 波多野结衣av一区二区av| 国产成人欧美在线观看| 国产成人系列免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 正在播放国产对白刺激| 日韩三级视频一区二区三区| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久久国内视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 最新在线观看一区二区三区| 午夜a级毛片| 脱女人内裤的视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久久久九九精品影院| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久草成人影院| 国产一卡二卡三卡精品| 色综合婷婷激情| 国产精品 国内视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美黄色淫秽网站| 1024香蕉在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 婷婷亚洲欧美| 国产亚洲av嫩草精品影院| av中文乱码字幕在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| 午夜亚洲福利在线播放| 女同久久另类99精品国产91| 精品无人区乱码1区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 91字幕亚洲| 成人亚洲精品av一区二区| 十八禁网站免费在线| 老司机深夜福利视频在线观看|