培養(yǎng)基中3株乳酸菌對7種有機磷農藥的降解作用

王晶，趙新淮

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

培養(yǎng)基中3株乳酸菌對7種有機磷農藥的降解作用

王晶，趙新淮

（東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

利用含有7種有機磷農藥的脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)3株乳酸菌，然后利用丙酮-乙腈（體積比為1︰4）提取液萃取脫脂乳培養(yǎng)基中的7種有機磷農藥，氣相色譜法測定這些有機磷的含量，并以此計算有機磷的降解動力學常數(shù)。結果表明，3株乳酸菌對有機磷農藥均有一定的降解效果，可不同程度減少了7種有機磷農藥的半衰期，其中植物乳桿菌1.0343的作用較強。

有機磷農藥；降解；乳酸菌；氣相色譜

0 引言

食品在維持人類生命至關重要，農藥的濫用造成環(huán)境污染并引起食品中蓄積農藥殘留。食品中超標的農藥殘留已威脅到百姓的食品安全性[1,2]。利用微生物降解環(huán)境中的有機磷農藥，是近年來的主要研究工作之一[3]。降解的途徑包括氧化、還原、水解、脫鹵、縮合、脫羧及異構化等[4]。王善銀等從農藥污染的土中分離出1株對甲基對硫磷對硫磷降解能力較強的黃桿菌[5]。肖華勝等從農藥廠污泥中分離到1株降解甲胺磷的假單胞菌，它在18 h內將質量濃度為1 000 mg/L的甲胺磷降解75%[6]。研究食品微生物對有機磷降解的降解作用，雖然現(xiàn)有報道不多，卻具有重要意義。食品中的有機磷分析一般用HPLC、GC等技術[7，8]。本文利用GC技術，研究3株乳酸菌在培養(yǎng)基中對有機磷的降解情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本單位收藏的3株乳酸菌，分別為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）1株，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1株，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）1株。

無抗脫脂乳粉；丙酮、乙腈、二氯甲烷、無水硫酸鈉等為分析純試劑，定容用的丙酮為色譜純；敵百蟲、甲拌磷、久效磷、樂果、倍硫磷、馬拉硫磷、甲基對硫磷等有機磷標樣。

氣相色譜儀為Agilent 7890（配火焰光度檢測器、7683B自動進樣器和30m×0.250mm×0.25 μm DB-1701色譜柱）。其他設備包括：LG10-2.4A型高速離心機，MTN-2800D型氮吹儀，SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，DHP-9082恒溫電熱培養(yǎng)箱滅菌鍋，YX-280手提式蒸汽滅菌鍋。

1.2 GC分析條件

載氣為高純氮氣（≥99.999%），流速10 mL/min；燃氣為高純H2（≥99.999%），流速75 mL/min；助燃氣為空氣，流速100 mL/min。進樣方式為不分流進樣，隔墊掃吹為3 mL/min。進樣體積1.0 μL，以保留時間定性，峰面積定量。

進樣口溫度為200℃，檢測器溫度為250℃，柱箱初始溫度為100℃，保留1 min；以30℃/min升至195℃，保留8 min；以10℃/min升至202℃，保留1 min；以1℃/min升至205℃，再以15℃/min升至240℃，保留5 min。

1.3 有機磷脫脂乳培養(yǎng)基的制備

脫脂乳粉與蒸餾水按1︰10混合均勻，添加7種有機磷農藥，其中久效磷、甲拌磷添加量為0.5 mg/kg,其他為1.2 mg/kg。取20 mL密封分裝在50 mL的三角燒瓶中，110℃滅菌10～15 min。

1.4 培養(yǎng)基的發(fā)酵

在室溫下向20 mL脫脂乳培養(yǎng)基中無菌操作接乳酸菌菌種，接菌量為3%。在42℃培養(yǎng)箱內分別培養(yǎng)8，12，16，20，24 h。不接乳酸菌的脫脂乳培養(yǎng)基做空白對照。

1.5 有機磷的提取與凈化

取脫脂乳培養(yǎng)基10 mL入離心管中，加入20 mL有機提取液（V丙酮︰V乙腈=1︰4），靜置0.5 h，振搖1 min，在離心機上以6 000 r·min-1離心6 min。上清液收集到150 mL的分液漏斗中，殘渣再加入20 mL的有機提取液（V丙酮︰V乙腈=1︰4），再提取一次，合并上清液。分液漏斗中加入40 mL二氯甲烷，劇烈振搖30 min，注意邊搖邊放氣，振搖完畢后靜置、分層。將分液漏斗中二氯甲烷層收集到三角瓶中，水相層再加入20 mL二氯甲烷重復提取一次。兩次收集到的二氯甲烷層通過3 g無水硫酸鈉抽濾收集于三角瓶中，然后移取15 mL至試管中，用氮吹儀吹至近干，色譜純丙酮定容到1.0 mL，0.45 μm的有機濾膜過濾，用外標法定量，測定樣品中有機磷含量。每個試驗重復2次。

1.67 種有機磷農藥熱降解動力學常數(shù)計算

相關研究結果證實，大部分有機磷的降解符合一級動力學[9-10]，即可以用化學反應一級動力學方程來描述。將不同時間脫脂乳培養(yǎng)基中7種有機磷農藥的濃度取對數(shù)對處理時間作圖，得出斜率為降解速度常數(shù)，并由速率常數(shù)計算半衰期。

2 結果與討論

2.1 有機磷的提取與GC分析

根據(jù)我們以前的研究結果，乳制品中有機磷農藥殘留的可以利用丙酮-乙腈混合和溶劑提取，經過二氯甲烷的凈化處理后直接在GC上分析[11]。在本研究中，采用了以前確定的處理、分析方法，對脫脂乳培養(yǎng)基中的有機磷進行提取、分析，所得到的典型譜圖如圖1所示，表明各有機磷得到很好的色譜分離。

圖1中，峰1至峰7分別為敵百蟲、甲拌磷、久效磷、樂果、倍硫磷、馬拉硫磷、甲基對硫磷。

2.2 脫脂乳培養(yǎng)基中有機磷農藥的降解

利用含有有機磷的脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)4株乳酸菌，并在不同發(fā)酵時間分析培養(yǎng)基中有機磷的殘留水平，對比對照樣，可以反映出乳酸菌對有機磷農藥降解的影響，結果如表1所示。

根據(jù)表1測定結果，通過回歸分析得到各個有機磷的降解反應速度常數(shù)，以及對應的半衰期，結果如表2所示。

與空白樣中有機磷的降解情況相比，由表2數(shù)據(jù)可已看出以下特征：

（1）敵百蟲、甲拌磷、久效磷、樂果、倍硫磷、馬拉硫磷、甲基對硫磷在脫脂乳培養(yǎng)基中，大體上，由于3株乳酸菌的作用而降解速度不同程度地增大，半衰期相應減少。我們過去的研究結果表明，酸奶發(fā)酵劑對有機磷存在降解促進作用[12]，這兩個研究結果之間存在一致性。

（2）不同乳酸菌的作用同一有機磷的作用效果不一樣，同一乳酸菌作用不同有機磷的效果也不一樣。

（3）綜合上看，馬拉硫磷、倍硫磷、甲拌磷、甲基對硫磷的半衰期減少幅度較大（分別約為6%～34%、7%～15%、8%～20%、0～28.2%），而敵百蟲、久效磷、樂果的半衰期減少幅度較?。ǚ謩e約為4%～9%、1%～10%、2%～10%）。

（4）整體上看，似乎植物乳桿菌1.0343的作用較強，而副干酪乳桿菌的作用一般較弱。

至于何種內在因素導致不同乳酸菌菌株對有機磷的降解作用效果不同，以及與有機磷的化學結構又有何關聯(lián)性，則有待進一步的研究。

表1 脂乳培養(yǎng)基中7種有機磷農藥的殘留情況

表2 不同乳酸菌對7種有機磷農藥降解動力學常數(shù)及半衰期

3 結論

（1）利用脫脂乳培養(yǎng)基和GC分析技術，確認了3株乳酸菌（保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌1.0343、副干酪乳桿菌）對培養(yǎng)基中的7種有機磷（敵百蟲、甲拌磷、久效磷、樂果、倍硫磷、馬拉硫磷、甲基對硫磷）存在一定的降解作用。

（2）在3株乳酸菌中，植物乳桿菌1.0343的作用較強一些而副干酪乳桿菌的作用較弱。3株乳酸菌對馬拉硫磷、倍硫磷、甲拌磷、甲基對硫磷的降解影響作用整體上較強，而對敵百蟲、久效磷、樂果的作用整體上較弱。

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[4]徐瑋.鄰單胞菌M6甲基對硫磷水解酶純化及性質的研究[D].南京:南京農業(yè)大學,2005.

[5]王善銀,龐學軍.黃桿菌P3-2分離及降解有機磷的某些性質[J].環(huán)境科學學報,1985,5(3):315-320.

[6]徐升.黑曲霉降解有機磷農藥氧樂果的性質研究[D].福州:福州大學,2003.

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Degradation of seven organophosphorus pesticides in the medium containing three Lactic acid bacteria

WANG Jing，ZHAO Xin-huai
(Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

ThreeLactic acid bacteriawere cultured in a skimmed milk medium containing seven organophosphorus pesticides.The organophosphorus pesticides were extracted from the medium with acetone and acetonitrile(v/v=1∶4)solution and determined in a gas chromatography. Degradation kinetics of the organophosphorus pesticides was calculated therefore.The results showed that threeLactic acid bacteriaaccelerated the degradation of the organophosphorus pesticides in different extents and decreased the half live period of the organophosphorus pesticides at different levels.Among theLactic acid bacteriastudied,Lactobacillus plantarum1.0343 exhibited the strongest effect on the degradation of the organophosphorus pesticides.

organophosphorus pesticides;degradation;Lactic acid bacteria;gas chromatography

Q935

A

1001-2230（2011）06-0037-03

2010-12-03

國家十一五奶業(yè)重大專項（2006BAD04A08-10）。

王晶（1985-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

趙新淮