氣相色譜-氮磷檢測器法表征家蠅對馬拉硫磷的水解代謝

張 怡, 史雪巖, 高希武

(中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 北京 100193)

家蠅作為重要的病媒昆蟲,對人畜健康等造成了巨大的危害[1,2]。目前對家蠅主要采用有機磷殺蟲劑、擬除蟲菊酯殺蟲劑、多殺菌素等進行化學控制,但是隨著化學殺蟲劑的廣泛使用,家蠅對殺蟲劑的抗性普遍出現(xiàn),影響了防治效果[3-5]。研究家蠅對殺蟲劑的抗性機制,對于掌握家蠅的抗性水平,制定合理的家蠅治理策略十分重要。

家蠅對殺蟲劑的抗性機制包括表皮變化導致的殺蟲劑穿透率降低、殺蟲劑靶標突變導致的對殺蟲劑敏感性降低以及昆蟲對殺蟲劑的解毒代謝能力增強導致的代謝抗性等[6]。目前,對于家蠅的殺蟲劑代謝抗性機制研究,已經(jīng)從生化水平的解毒酶活性研究,深入到分子水平的解毒酶基因研究等。其中,比較研究抗性與敏感昆蟲對殺蟲劑的代謝能力差異,可以為表征抗性昆蟲對殺蟲劑的代謝抗性提供直接的證據(jù)。因此,準確表征抗性昆蟲和敏感昆蟲對殺蟲劑的代謝能力差異,十分重要。

馬拉硫磷是一種有機磷殺蟲劑,具有對害蟲防治效果好、對人低毒的選擇性,被廣泛用于家蠅防治[7],但是家蠅對馬拉硫磷的抗性已被報道[8]。有機磷殺蟲劑的生物代謝轉(zhuǎn)化反應主要包括氧化、水解、軛合等,其中,水解是有機磷殺蟲劑在生物體內(nèi)發(fā)生的重要解毒代謝反應之一[9]。對馬拉硫磷的代謝研究表明,羧酸酯酶對馬拉硫磷分子中的羧酸酯鍵具有一定的水解作用。在哺乳動物體內(nèi),馬拉硫磷容易被羧酸酯酶水解成低毒的馬拉硫磷一元羧酸而解毒,但是在昆蟲中這個解毒反應活性很低,因而馬拉硫磷在昆蟲中難以解毒,而對昆蟲產(chǎn)生毒殺作用[9,10]。研究[10,11]發(fā)現(xiàn),昆蟲對有機磷的抗性與其對有機磷的水解解毒能力增強有關。如抗有機磷類殺蟲劑的蟑螂和蒼蠅種群的抗性產(chǎn)生與脂族酯酶包括羧酸酯酶的過量表達有關。此外,研究[10-12]表明,一些昆蟲對有機磷的水解抗性與酯酶突變有關,并且這個突變還伴隨著脂族酯酶活性的降低,因而提出了脂族酯酶突變理論。但是,對于直接比較敏感昆蟲和抗性昆蟲對馬拉硫磷的水解能力差異,還很少研究。

為表征昆蟲解毒代謝酶對馬拉硫磷的代謝能力,可以通過分析馬拉硫磷與昆蟲解毒酶溫育后,馬拉硫磷的含量變化而進行。因此準確分析馬拉硫磷的含量很重要。對于馬拉硫磷等有機磷殺蟲劑的分析,可以采用的方法有氣相色譜-火焰光度法[13,14]、氣相色譜-氮磷檢測器(GC-NPD)法[15]、GC-MS法[16-18]、UPLC-MS/MS法[19]等。其中氣相色譜配高靈敏度、高選擇性的NPD,在含氮及含磷化合物的分析檢測中,被廣泛應用[20]。GC-NPD已被用于有機磷殺蟲劑馬拉硫磷的檢測。用乙腈提取甘藍樣品中的有機磷農(nóng)藥后,使用配有DB-1701毛細管柱的GC分離,再用NPD檢測,可成功測定包括馬拉硫磷在內(nèi)的5種有機磷殺蟲劑殘留[15]。對豬肉樣品,用乙酸乙酯與正己烷的混合物提取后,用HP-1毛細管氣相色譜柱進行分離,用GC-NPD法分析測定二嗪農(nóng)殘留[21]。對甘蔗汁樣品,使用QuEChERS結合GC-NPD法可成功測定其中的有機磷農(nóng)藥殘留量[22]。此外,用正己烷抽提昆蟲羧酸酯酶與馬拉硫磷的混合物后,使用GC-NPD測定了7種昆蟲野生型和兩種突變型的羧酸酯酶對馬拉硫磷的降解,發(fā)現(xiàn)突變能使一些昆蟲的羧酸酯酶對馬拉硫磷的降解活性增加[12]。家蠅等昆蟲樣品具有脂肪含量高、基質(zhì)干擾強的特點,導致昆蟲樣品中馬拉硫磷的提取效率較低、難以分析準確。本研究使用2∶1(v/v)的乙酸乙酯與正己烷混合物作為提取劑,可以高效地提取家蠅酶制備液中的馬拉硫磷,并進行準確分析。因此,在篩選獲得了對馬拉硫磷具有624倍抗性的家蠅品系的基礎上,用常規(guī)模式底物α-萘乙酯(α-NA)表征了敏感及抗性家蠅的羧酸酯酶活性差異,并使用GC-NPD比較了抗性及敏感家蠅酶制備液對馬拉硫磷的水解代謝差異。該研究為明確家蠅對馬拉硫磷的代謝抗性機制,提供了研究數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

HP 6890+氣相色譜儀,配有分流/不分流進樣口和NPD;數(shù)據(jù)采集使用Agilent Chromatograpahic Data Station(美國Agilent公司)。Eppendorf Centrifuge 5417C/R型臺式高速(冷凍)離心機(德國Eppendorf公司); UV2550型紫外分光光度計(日本Shimadu公司), Tecan Spectra Rainbow Microplate Reader(瑞士TECAN公司)。

α-NA(純度≥98%)、毒扁豆堿(eserine,純度≥98%)、固藍B鹽(fast blue B salt,純度≥80%)均購自美國Sigma-Aldrich公司;考馬斯亮藍G-250(分析純)購自上?；瘜W試劑公司。牛血清白蛋白(BSA,純度≥98%)購自北京同正生物公司。十二烷基硫酸鈉(SDS)、KH2PO4及Na2HPO4等均為分析純,購自北京化學試劑公司產(chǎn)品;正己烷(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)均購自美國Fisher公司。馬拉硫磷原油(純度≥96%)購自山東德州農(nóng)化公司。

供試家蠅:室內(nèi)飼養(yǎng)的條件為光照14 h,溫度為(25±1) ℃,相對濕度為60%～70%,用水、糖和奶粉飼養(yǎng)。由中國農(nóng)業(yè)大學毒理實驗室飼養(yǎng)。其中,馬拉硫磷敏感家蠅品系(SS)是1987年從臺灣大學獲贈,已經(jīng)在實驗室內(nèi)沒有接觸任何殺蟲劑的條件下,飼養(yǎng)超過了40年。馬拉硫磷抗性家蠅品系(RS)是通過將2007年采自中國農(nóng)業(yè)大學的家蠅,用馬拉硫磷篩選獲得。篩選參考文獻[11]進行。具體的篩選方法是通過將馬拉硫磷的丙酮溶液點滴在剛孵化的家蠅的前胸背板,其中馬拉硫磷的使用劑量可以導致受試家蠅60%～80%的死亡率,在處理后72 h,將仍存活的家蠅作為母體繼續(xù)繁殖下一代。通過連續(xù)多代的篩選,獲得了624倍抗性的馬拉硫磷抗性品系(RS)。其中,對敏感家蠅品系,馬拉硫磷的半致死劑量(LD50)為0.83 μg/fly(95%置信區(qū)間為0.71～0.97 μg/fly),對抗性家蠅品系,馬拉硫磷的LD50為518 μg/fly(95%置信區(qū)間為470～5 690.71 μg/fly)[11]。分別收集敏感、抗性雌家蠅成蟲,去頭后,取腹部用于實驗。

1.2 色譜條件

色譜柱為HP-5(30 m×0.25 mm×0. 31 μm,美國Agilent公司)。氣化室溫度為280 ℃,檢測器溫度為325 ℃,柱溫為200 ℃。載氣為高純氮氣(純度99.9%)。載氣流速為2.1 mL/min。采用分流進樣,分流比為5∶1,進樣量為2 μL。

1.3 家蠅酶勻漿液的制備

解剖獲得4日齡的雌家蠅成蟲腹部,將5個雌家蠅腹部用冰冷0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液勻漿,在4 ℃下以12 097 r/min的速度離心15 min。收集上清液,作為酶制備液,用于體外測定其對α-NA及馬拉硫磷的代謝活性。其中,每個家蠅品系均分別制備3個酶制備液,作為3個生物學重復。

使用考馬斯亮藍G-250方法測定家蠅酶制備液的蛋白質(zhì)含量。采用3 mL的反應體系:0.5 mL酶制備液及2.5 mL考馬斯亮蘭G-250。室溫反應5 min后,測定595 nm下的吸光值。以牛血清白蛋白作標準曲線,計算酶制備液中蛋白質(zhì)的含量。

為了研究家蠅對馬拉硫磷的抗性與家蠅對馬拉硫磷的水解活性的關系,分別測定了馬拉硫磷抗性家蠅和敏感家蠅對模式底物α-NA、馬拉硫磷的水解代謝活性。

1.4 家蠅酶制備液對α-NA的水解活性測定

羧酸酯酶活性的測定參照文獻方法[11]進行。以α-NA(母液濃度為3×10-2mol/L)為底物,使用時與毒扁豆堿(母液濃度為3×10-2mol/L)一起用0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液(PBS)稀釋至3×10-4mol/L。取50 μL酶制備液加入到含0.45 mL 0.04 mol/L pH 7.0的PBS以及3.6 mL 3×10-4mol/Lα-NA的反應溶液中啟動反應,在30 ℃恒溫水浴中振搖反應15 min后,加入0.9 mL顯色劑(體積比為1∶1的0.01 g/mL固藍B鹽水溶液與0.05 g/mL SDS水溶液的混合液)終止反應,于600 nm下測定光吸收值。每個處理重復3次,每個重復進行3次測定。將所測定的吸光值除以所使用的酶蛋白含量和酶反應時間,即可計算出羧酸酯酶的比活力。因此,以mOD/(mg protein·min)作為羧酸酯酶比活力的單位。

1.5 家蠅酶制備液對馬拉硫磷的水解代謝活性測定

用家蠅酶制備液進行對馬拉硫磷水解代謝反應的體系總體積為800 μL。其中,含有100 μL的家蠅酶制備液,0.1 mmol/L馬拉硫磷作為底物,在30 ℃下溫育45 min。反應完畢,加入1 mL冰冷的乙酸乙酯-正己烷(2∶1, v/v),渦旋后,收集有機相,共萃取3次。合并3次萃取液,用無水硫酸鈉干燥后,轉(zhuǎn)移至新的玻璃管中,N2吹濃縮至干,用200 μL正己烷定容后,用于GC-NPD分析代謝反應后馬拉硫磷的剩余量。其中,每個酶代謝反應重復3次。其中,設酶液對照(不加底物)和底物對照(不加酶液),以確保檢測的馬拉硫磷來自酶促反應體系,而不是來自酶或底物。

將GC-NPD所測定的馬拉硫磷峰面積,用馬拉硫磷的標準曲線換算為酶代謝反應后的馬拉硫磷量。根據(jù)所加底物的量及酶反應后剩余馬拉硫磷的量,即可計算出酶代謝反應所消耗的馬拉硫磷的量；再除以所使用的酶蛋白含量和酶反應時間,即可計算出家蠅羧酸酯酶對馬拉硫磷的水解代謝比活力,因此,酶活性的單位為nmol malathion/(mg protein·min)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

利用統(tǒng)計分析軟件GraphPad Instat 3.00對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用t-檢驗分析兩組數(shù)據(jù)的差異顯著性,以P<0.05作為差異顯著性標準。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

在本文使用的GC-NPD分析馬拉硫磷的條件下,馬拉硫磷的標準曲線為y=0.269 4x-0.357 9,x為馬拉硫磷的峰面積,y為馬拉硫磷的濃度(μmol/L),相關系數(shù)R2=0.998。馬拉硫磷的檢出限為1.982 ng。家蠅酶制備液中添加水平為0.075、0.15、0.75和1.5 mmol/L的馬拉硫磷回收率分別為87.55%±3.00%、89.4%±3.60%、91.27%±2.34%、96.00%±0.09%。表明本工作使用的GC-NPD分析馬拉硫磷的方法具有良好的靈敏度及準確度,可用于家蠅酶制備液代謝反應中馬拉硫磷含量的測定。

圖 1 家蠅酶制備液對馬拉硫磷的水解代謝Fig. 1 Hydrolytic metabolism of malathion by the homogenate of M. domestica

2.2 敏感家蠅、抗性家蠅酶制備液對α-NA的水解活性

馬拉硫磷敏感、抗性家蠅酶制備液對α-NA的水解活性見表1。結果表明,以α-NA為底物,馬拉硫磷抗性家蠅的酶制備液對α-NA的水解活性明顯高于敏感家蠅,是敏感家蠅水解酶活性的1.39倍。

表 1 馬拉硫磷敏感、抗性家蠅酶制備液對α-NA及 馬拉硫磷的水解活性(n=3)Table 1 Hydrolysis activities of the enzyme preparation of malathion-susceptible and resistant Musca domestica (M. domestica) to α-naphthyl acetate (α-NA) and malathion (n=3)

The hydrolysis activity data were presented as mean±standard error (SE) of the three replicates. * significantly different (P<0.05, using pairedt-tests).

2.3 敏感家蠅、抗性家蠅酶制備液對馬拉硫磷的水解活性差異

馬拉硫磷敏感、抗性家蠅酶制備液對馬拉硫磷的水解活性結果見表1和圖1。從圖1可以看出,與敏感家蠅酶制備液溫育后導致的馬拉硫磷減少量相比,抗性家蠅酶制備液與馬拉硫磷溫育后,馬拉硫磷減少的更多,表明抗性家蠅對馬拉硫磷的水解活性顯著超過了敏感家蠅的代謝活性。從表1的結果可以看出,抗性家蠅是敏感家蠅對馬拉硫磷的水解活性的6.68倍。

已有研究報道了抗性昆蟲的羧酸酯酶對模式底物α-NA的水解活性增加與昆蟲對殺蟲劑的抗性有關。因此,很多研究[10]將昆蟲對α-NA的水解活性,用于表征昆蟲對殺蟲劑的代謝抗性。但是,在對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的一些昆蟲中,卻觀察到了昆蟲羧酸酯酶對α-NA水解活性的降低,并因此提出了“脂族酯酶突變”理論[23,24],認為在對有機磷產(chǎn)生抗性的昆蟲中,可以水解α-NA的脂族酯酶發(fā)生了突變,導致了脂族酯酶對于α-NA的水解能力降低,同時卻增加了其對有機磷殺蟲劑的水解代謝能力。因此,表征昆蟲對α-NA的水解能力,不能準確表征昆蟲對有機磷殺蟲劑的代謝及相關抗性。

由于昆蟲酶制備液對不同底物的水解能力與底物的結構密切相關,使用殺蟲劑作底物才能準確表征昆蟲酶制備液對殺蟲劑的水解代謝能力。因此,本研究直接使用殺蟲劑馬拉硫磷作底物,比較研究了馬拉硫磷抗性、敏感家蠅對馬拉硫磷的水解代謝活性差異,并與對α-NA的水解代謝活性差異進行了比較。結果表明,與敏感家蠅相比,抗性家蠅對α-NA的水解能力增加到原來的1.39倍,而對馬拉硫磷的水解能力增加到原來的6.68倍,說明抗性家蠅酶制備液對α-NA和馬拉硫磷的水解能力均有所增加,但增加的程度有所不同,因此,僅檢測昆蟲酶制備液對α-NA的水解能力不能準確表征其對馬拉硫磷的代謝能力。在本研究結果中,抗性家蠅對馬拉硫磷的水解代謝能力顯著增強,這為明確家蠅對馬拉硫磷的水解代謝能力增強導致了家蠅對馬拉硫磷有抗性提供了直接的證據(jù),然而研究結果同時表明，抗性家蠅對以α-NA為代表的羧酸酯的水解能力并沒有增強很多,這也在一定程度上,與脂族酯酶突變理論一致。

對昆蟲代謝抗性機制的研究,目前已從表征解毒酶活性變化的生化機制研究深入到表征解毒酶基因變化的分子機制研究。雖然本研究表明抗性家蠅的羧酸酯酶制備液對馬拉硫磷的代謝能力顯著升高,但是對于這是由于羧酸酯酶表達量的增加還是由于羧酸酯酶突變導致的代謝能力增強所致,還需要深入研究其分子機制而確定。此外,本研究使用的解毒酶是雌家蠅腹部制備的粗酶液,為準確表征解毒酶對殺蟲劑的代謝,還應把相關的解毒酶基因進行克隆及表達后,深入研究其對馬拉硫磷的代謝,將可以得到更為準確的結果。

本研究明確了家蠅羧酸酯酶對馬拉硫磷水解能力的增加是家蠅對馬拉硫磷抗性的機制之一,對于開發(fā)馬拉硫磷水解酶的抑制劑、提高家蠅對馬拉硫磷的敏感性、有效使用馬拉硫磷進行家蠅治理具有重要意義。此外,研究結果對于將相關的解毒酶基因進行干擾,降低其對馬拉硫磷的水解代謝能力,有效進行家蠅治理也提供了研究基礎。昆蟲殺蟲劑的抗性機制是多方面的因素導致的,除代謝抗性外,靶標抗性和穿透抗性對家蠅馬拉硫磷抗性的貢獻,還需要使用其他方法進行表征和研究。

3 結論

本研究建立的經(jīng)正己烷和乙酸乙酯萃取、GC-NPD測定馬拉硫磷的方法,可成功表征復雜昆蟲酶代謝反應中馬拉硫磷含量的變化,從而可準確表征家蠅等昆蟲對馬拉硫磷的代謝抗性。