植物乳桿菌胞外多糖對小鼠樹突狀細(xì)胞分泌的調(diào)控

董偉，唐彥君，劉寧，2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086)

植物乳桿菌胞外多糖對小鼠樹突狀細(xì)胞分泌的調(diào)控

董偉1，唐彥君1，劉寧1，2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086)

采用細(xì)胞因子誘導(dǎo)法，以加入重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重組小鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)及10%胎牛血清的RPMI1640為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞(DCs)。實(shí)驗(yàn)組加入植物乳桿菌胞外多糖，脂多糖LPS和RPMI1640分別作為陽性和空白對照。采用Griess法和雙抗體夾心ELISA檢測DCs分泌NO，促炎癥因子IL-12p70，抗炎癥因子IL-10和趨化因子RANTES的濃度。結(jié)果表明：植物乳桿菌胞外多糖刺激DCs后，DCs分泌NO、IL-12p70、IL-10和RANTES的濃度分別是空白組的110%、194%、76%和133%，且呈劑量依賴關(guān)系。植物乳桿菌胞外多糖能促進(jìn)小鼠骨髓來源的DCs分泌能力。

植物乳桿菌胞外多糖；樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子；分泌

0 引言

樹突狀細(xì)胞(dentritic cell,DC)是目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞[1]，是唯一能激活CD4+Th0細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，在機(jī)體的免疫防御中起特殊功能[2,3]。尤其Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分化和功能平衡在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)中占有重要位置。Th0細(xì)胞的分化受DC所控制[4,5]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到周圍培養(yǎng)基的黏液多糖(slime polysaccharides, SPS)以及連接在菌體表面的莢膜多糖(capsularpolysaccharides,CPS)的總稱[6]。它不僅具有改善發(fā)酵食品流變、口感和質(zhì)構(gòu)的重要作用，而且具有促進(jìn)人體健康的重要生理作用，如抗誘變、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇等活性[7]。本研究探討植物乳桿菌胞外多糖對體外培養(yǎng)小鼠骨髓DCs分泌功能的調(diào)控作用，以進(jìn)一步闡明植物乳桿菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本研究動物規(guī)格BALB/cj(I-Ad)小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，周齡6～8周，SPF級。飼養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境，環(huán)境溫度24℃，濕度40%～60%，光照12 h，實(shí)驗(yàn)前靜養(yǎng)1周左右。

1.2 菌種

植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，經(jīng)16S rDNA序列比對鑒定為植物乳桿菌。

1.3 試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)液，胎牛血清，重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子rmGM-CSF及重組小鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)，磷酸脂多糖LPS，NO檢測試劑盒，小鼠IL-12p70 ELISA檢測試劑盒、小鼠IL-10 ELISA檢測試劑盒和小鼠RANTES ELISA檢測試劑盒。其他化學(xué)試劑NaCl，KCl，NH4Cl，NaHPO4·H2O，KH2PO4和HCl等均為分析純。實(shí)驗(yàn)用設(shè)備HF90型CO2培養(yǎng)箱，DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，GL-21M型高速冷凍離心機(jī)，LD4-2型低速離心機(jī)，真空冷凍干燥機(jī)，倒置顯微鏡，酶聯(lián)免疫檢測儀。

2 方法

2.1 植物乳桿菌胞外多糖的提取

植物乳桿菌(L.plantarum)按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接種于SDM培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h后，經(jīng)離心、三氯乙酸脫蛋白、乙醇沉淀、透析和凍干等步驟分離純化得到粗胞外多糖，命名為EPS[8]。

2.2 小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)及培養(yǎng)

小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的分離與培養(yǎng)主要是參照Inaba[9～11]等人的方法并稍做改動，取6～8 w周齡，體重18～22 g BALB/cj(I-Ad)小鼠，雌雄各半。經(jīng)脫頸椎處死，立即浸入體積分?jǐn)?shù)為75%酒精中浸泡5 min，于超凈臺內(nèi)無菌分離股骨和脛骨，將肌肉和肌腱去除干凈后放入無菌PBS中。剪掉股骨兩端，以無菌注射器吸取1 mL RPMI1640培養(yǎng)液，沖洗骨髓，可沖洗出絕大部分的骨髓細(xì)胞。經(jīng)Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞后，懸浮于含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液其中含有rmGM-CSF(終質(zhì)量濃度20 μg/L)和rmIL-4(終質(zhì)量濃度20 μg/L)，放入37℃（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后傾去懸浮的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液，同時(shí)補(bǔ)足rmGM-CSF和rmIL-4的濃度，96 h后半量換液，在第6 d收集疏松貼壁的細(xì)胞為小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)備用。

2.3 細(xì)胞因子分泌的誘導(dǎo)

用無菌吸管將培養(yǎng)6 d的半貼壁的樹突狀細(xì)胞輕輕吹下，在300 g條件下離心5 min收集細(xì)胞，重新懸浮于RMPI1640完全培養(yǎng)基中，并補(bǔ)足rmGM-CSF和rmIL-4，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105mL-1，按每孔1 mL的劑量加入到細(xì)胞24孔板中，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組加入植物乳酸菌胞外多糖EPS終質(zhì)量濃度為分別為25，50，100，150和200 mg/L；其他孔則加入終質(zhì)量濃度為1 mg/L的脂多糖(LPS)和適量的RPMI1640完全培養(yǎng)液的孔作為陽性對照和空白對照。將24孔板放入37℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液凍存于-80℃冰箱。

2.4 細(xì)胞因子的檢測

收集共培養(yǎng)的上清液，Griess法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NO2-，間接反映DCs生成NO的量，按照說明書進(jìn)行操作。NO濃度=測定管吸光度-空白管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)品濃度100 μmol/L×樣品測試前稀釋倍數(shù)。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12p70、IL-10和RANTES的濃度，實(shí)驗(yàn)按照ELISA試劑盒的操作步驟來進(jìn)行。反應(yīng)終止后用酶標(biāo)(BIO-TEK)檢測450 nm吸光度(A450)值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定細(xì)胞因子的濃度。

2.5 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)以±s表示。應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用One-wayANOVA方法分析各組之間差異顯著性。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 EPS對BMDCs分泌因子NO的影響

EPS對DCs分泌炎癥因子NO的影響情況如圖1所示。實(shí)驗(yàn)組和對照組DCs均分泌因子NO，不同濃度EPS作用DCs分泌NO的能力均有所提高，Griess法結(jié)果顯示DC在未做任何處理時(shí)(即RPMI1640組)NO分泌的量為298.38±1.13 μmol/L，經(jīng)EPS處理的DC能夠分泌高水平的NO，在EPS質(zhì)量濃度為50、100和200 μg/mL時(shí)，NO分泌量分別為308.03±0.28、315.63±0.20和329.52±0.45 mol/L。

圖1中，*為與空白組相比顯著，P＜0.05；**為與空白組相比極顯著，P＜0.01。下同。

NO在哺乳動物機(jī)體的物質(zhì)代謝、信息傳遞以及防御疾病方面起重要作用。目前很多研究表明，NO的誘導(dǎo)合成是活化的巨嗜細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制之一。本結(jié)果顯示植物乳桿菌胞外多糖能夠提高DCs分泌NO的能力，說明EPS可通過增強(qiáng)DCs的分泌NO來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，進(jìn)而起到抗腫瘤活性的功能。

3.2 EPS對BMDCs分泌促炎癥因子IL-12p70及抗炎癥因子IL-10的影響

IL-12p70是初始T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞過程中分泌的Th1型細(xì)胞因子，而IL-10則是Th2型細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2（a）可知，RPMI1640組共培養(yǎng)的DCs IL-12p70分泌的量為（52.25±2.00）ng/L，經(jīng)EPS 25、50、100、150 mg/L和200 mg/L處理后，IL-12p70的分泌量分別為82.92±1.89、86.92±2.08、88.25±1.80、 92.25±2.50及（101.25±3.00）ng/L。表明EPS各組均刺激未成熟DCs分泌Th1型細(xì)胞因子IL-12p70(P＜0.01)，相反從圖2（b）中可以看出，EPS各濃度均降低DCs分泌IL-10的能力(P＜0.01)，說明DCs對Th2型細(xì)胞因子IL-10的分泌則具有顯著抑制作用。IL-10分泌量降低與IL-12p70分泌量的增加是呈正相關(guān)的。

3.3 EPS對BMDCs分泌趨化因子RANTES的影響

由圖3可知，與未處理組相比(60.91 ng/L±9.48 ng/L)，EPS處理組RANTES的分泌均顯著升高(P＜0.05)。表現(xiàn)為：EPS質(zhì)量濃度為25、100和200 mg/L時(shí)，對應(yīng)的RANTES的分泌量分別為64.46±7.53、70.62± 6.62及(81.05±4.90)ng/L，呈劑量依賴關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)EPS能夠刺激未成熟DCs分泌Th1型細(xì)胞因子IL-12p70，對Th2型細(xì)胞因子IL-10的分泌則具有顯著抑制作用(P＜0.05)，并且這種作用呈劑量依賴性，同時(shí)EPS能夠誘導(dǎo)未成熟DCs分泌RANTESThl型趨化因子和NO，而且這種促進(jìn)作用在較低濃度比較顯著(P＜0.05)。由此可見，EPS可以通過調(diào)節(jié)DCs分泌不同類型的細(xì)胞因子及趨化因子，誘導(dǎo)機(jī)體偏向Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及促進(jìn)機(jī)體由固有性免疫向適應(yīng)性免疫過渡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示EPS的免疫調(diào)節(jié)活性與EPS提高DCs的分泌能力有關(guān)，可以為EPS的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制做初步解釋。但是，EPS對DCs分泌功能影響的分子免疫學(xué)機(jī)制還不是很清楚，有待于進(jìn)一步研究。

[1]ALBERT M L,PEARCE S F,FRANCISCO L M,et al.Immature Dendritic Cells Phagocytose Apoptotic Cells via αVβ5 and CD36,and Cross-Present Antigens to Cytotoxic T Lymphocytes[J].Exp Med, 1998,188(7):1359-1368.

[2]STEINMAN R M.The Dendritic Cell System and Its Role in Immunogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9:271-296.

[3]JACQUES B,RALPH M.Dendritic Cells and the Control of Immunity[J].Nature,1998,392(19):245-252.

[4]KRONON,V H.HOCHREIN,K.SHORTMAN,et al.Regulation of T Cell Cytokine Production by Dendritic Cells[J].Immunology and Cell Biology,2000,78:214-223.

[5]KALINSKI P,HILKENS C M,WIERENGA E A,et al.T-Cell Priming by Type-1 and Type-2 Polarized Cendritic Cells:the Concept of a Third Signal[J].Immunol Today,1999,20:561-567.

[6]DE VUYST L,DEGEEST B.Heteropolysaccharides from Lactic Acid Bacteria[J].FEMS Microbiol Rev,1999,23(2):153-177.

[7]郭本恒.益生菌[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[8]KIMMEL S A,ROBERT R F.Development of a Growth Medium Suitable for Exopolysaccharide Production by Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus RR[J].Int.J.Food Microbiol,1998,40(1/2):87-92.

[9]INABA K.,INABA M,ROMANI N,et al.Generation of Large Numbers of Dendritic cells From Mouse Bone Marrow Cultures Supplemented with Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor [J].Exp Med,1992,176(6):1693-1702.

[10]LUTZ M B,KUKUTSCH N,OGILVIE AL,et al.An Advanced Culture Method for Generating Large Quantities of Highly Pure Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow[J].Immunol Methods, 1999,223:77-92.

[11]CAO X,ZHANG W,HE L,et al.Lymphotactin Gene-Modified Bone Marrow Dendritic Cells Act as more Potent Adjuvants for Peptide Delivery to Induce Specific Antitumor Immunity[J].Immunol, 1998,161(11):6238-6244.

Effects of exopolysaccharide from Lactobacillus plantarum on secretion of dendritic cells in the mouse marrow

DONG Wei1,TANG Yan-jun1,LIU Ning1，2
(1.Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,College of Food Science,Northeast Agricultural University, Harbin 150030，China;2.National Dairy Engineering&Technical Research Center,Harbin 150086，China)

By cytokine-induce method dendritic cells(DCs)generated from bone marrow of BALB/c mouse were cultured in complete RPMI 1640 medium containing 10%FBS,rmGM-CSF and rmIL-4.Lactobacillus exopolysaccharide,lipopolysaccharide LPS and RPMI1640 were added to cells,respectively.Level of NO was detected by NO analyzing Kit.The level of mouse IL-12p70,IL-10 and RANTES in culture supernatant was determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay.Lactobacillus exopolysaccharide could increase the secretion of NO,proinflammatory factor IL-12p70,anti-inflammatory factor IL-10 and chemokines RANTES,were 110%,194%,76%and 133%of the control group respectively,and expressing dose-dependent effect.Lactobacillus exopolysaccharide could promote the secretion of murine bone marrow-derived.

Lactobacillus exopolysaccharides;dendritic cell;cell factor;secretion

Q93-33

A

1001-2230（2011）06-0014-03

2011-03-21

教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金(IRT-0959-202)；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2011RFXXN042)。

董偉（1984-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)。

劉寧