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    乳及乳制品三聚氰胺殘留HPTLC檢測方法的初步建立

    2011-01-08 05:38:58孟蘭環(huán)劉興凱郭軍
    中國乳品工業(yè) 2011年6期
    關(guān)鍵詞:展開劑三聚氰胺牛乳

    孟蘭環(huán),劉興凱,郭軍

    (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,呼和浩特 010018)

    乳及乳制品三聚氰胺殘留HPTLC檢測方法的初步建立

    孟蘭環(huán),劉興凱,郭軍

    (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,呼和浩特 010018)

    以開發(fā)低成本和高通量的三聚氰胺(MA)檢測方法為目的,初步建立用高效薄層色譜(HPTLC)檢測乳及乳制品中三聚氰胺的方法。用高效硅膠G板,以四氫呋喃、水和冰醋酸為展開劑,氯氣和碘-淀粉試劑為顯色劑檢測牛乳中的MA,檢出限可達(dá)5~2.5 mg/L;而用一種初步嘗試的濃縮展開原理,MA檢出限可達(dá)1.0~0.5 mg/L水平。利用HPTLC完全可以建立一類廉價(jià)、操作簡便和高檢測效率的MA殘留檢測方法。

    三聚氰胺;薄層層析;牛乳

    0 引言

    2010年11月國家質(zhì)檢總局頒布了“乳制品和嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)許可條件審查細(xì)則”,其中有條款要求企業(yè)必需自行嚴(yán)格檢測三聚氰胺(Melamine,MA)。然而國家推薦的三種MA檢測方法[1-3]設(shè)備昂貴,維持和耗材費(fèi)用高,實(shí)驗(yàn)室條件要求高,操作復(fù)雜耗時(shí)。企業(yè)為滿足高通量、快速檢測需要,還采用昂貴的進(jìn)口免疫標(biāo)記試劑盒。2009年以來我們嘗試用高效薄層色譜(High Performance Thin Layer Charamotograph,HPTLC)法檢測牛乳中污染的MA,檢出限可達(dá)5.0 mg/L水平(圖1)??上驳氖墙?jīng)過展開原理的創(chuàng)新性改進(jìn)(樣品在展開過程中被濃縮),檢出限可達(dá)1.0 mg/L,甚至達(dá)0.5 mg/L水平(圖2),但可重復(fù)性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究提高。現(xiàn)將成熟的部分簡報(bào)如下。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 材料

    普通硅膠G60層析板(自制)[4],預(yù)制高效硅膠G板(批次:2010年8月,規(guī)格100 mm×100 mm和100 mm× 150 mm),四氫呋喃、冰醋酸、高錳酸鉀、鹽酸、可溶性淀粉、碘化鉀均為分析純。三聚氰胺(MA)標(biāo)準(zhǔn)品,純度99%,進(jìn)口分裝。

    SB-3型薄層色譜噴霧泵。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)MA牛乳制備

    準(zhǔn)確稱取0.01 g三聚氰胺,用無MA牛乳溶解定容至100 mL,相當(dāng)于含100 mg/L的三聚氰胺牛乳溶液,再用無MA牛乳制備100 mg/L至0.5 mg/L的MA標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度系列,點(diǎn)樣時(shí)用蒸餾水做1:1稀釋。見表1。

    1.2.2 氯氣的制備

    按無機(jī)化學(xué)氯氣制備原理和反應(yīng)式制備。稱取3 g高錳酸鉀和5 mL濃鹽酸在氯氣制備器中混合,制得1 L氯氣,通入密閉容器保存。

    1.2.30.5%淀粉碘化鉀溶液的制備

    稱取可溶性淀粉0.5 g加入至100 mL溫度為80~90℃的蒸餾水中,煮沸至完全透明,冷卻至室溫,加入0.5 g KI溶解,過濾,避光冷藏保存[5]。

    1.2.4 點(diǎn)樣

    將MA標(biāo)準(zhǔn)牛乳溶液和指控樣品牛乳用蒸餾水做1︰1稀釋(體積比)。然后在距薄層板底邊1.0 cm處手工點(diǎn)狀點(diǎn)樣2.0 μL,點(diǎn)間距為10 mm。100×100 mm薄層板可點(diǎn)9個(gè)乳樣,100×150 mm可點(diǎn)14個(gè)乳樣,100× 200 mm可點(diǎn)19個(gè)乳樣。

    1.2.5 展開

    基本展開劑為四氫呋喃︰水(9.5︰0.5,體積比)、四氫呋喃︰水︰冰醋酸(9.5︰0.25︰0.25,體積比),另外初試了一種創(chuàng)新性原理的“濃縮展開劑”。均上行展開,無需飽和,展開劑距原點(diǎn)0.5 cm,展距7 cm,展開時(shí)間均約10 min。

    1.2.6 顯色

    將展開后的薄層板在空氣中晾干,置于充滿氯氣的密閉容器中5 min,取出,通風(fēng)放置5 min揮發(fā)氯氣,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%淀粉碘化鉀溶液噴霧顯色后目視觀察結(jié)果。在背景光下觀察結(jié)果更明顯。

    2 結(jié)果

    結(jié)果如表1,圖1和圖2所示。普通層析板上檢出限在50~40 mg/L左右;本次使用的國產(chǎn)高效層析板用常規(guī)展開原理檢出限可達(dá)30~20 mg/L,使用本研究創(chuàng)新的濃縮展開原理后,檢出限可達(dá)5.0~2.5 mg/L。而初步優(yōu)化的濃縮展開劑,可使薄層層析檢出限達(dá)1.0 mg/L,甚

    圖2中,1,2,4,6,8,10,12道MA質(zhì)量濃度分別為10,8.0,6.0,4.0,2.0,1.0,0.5 mg/L;3,5,7,9,11道為被檢乳樣,MA質(zhì)量濃度約2.5 mg/L。至0.5 mg/L。用四氫呋喃和蒸餾水為展開劑,容易出現(xiàn)Rf值與MA接近的干擾物質(zhì),而用冰醋酸酸化的展開劑和濃縮展開劑則對MA的分離效果增強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)使用的高效層析板,MA的Rf值為0.5,不同濃度樣品的Rf值一致,沒有干擾物質(zhì)。采用濃縮展開原理,展開中MA被濃縮,因此斑點(diǎn)呈橢圓型(圖1)、弦月形或線形(圖2),檢出限大大提高。

    一個(gè)薄層板操作時(shí)間30~60 min,一個(gè)100×100 mm的小型薄層板可檢測5~9個(gè)乳樣,而100×150 mm或100×200 mm的薄層板可檢測14~19個(gè)樣品,則一個(gè)乳樣平均檢測時(shí)間僅為數(shù)分鐘。顯然HPTLC檢測效率很高,適合大批量乳樣的MA檢測。

    3 討論

    表1 標(biāo)準(zhǔn)MA牛乳濃度和HPTLC檢測結(jié)果

    圖1中,從左至右MA質(zhì)量濃度為0,50,40,30,20,10,5,2.5 mg/L。使用了樣品斑點(diǎn)濃縮技術(shù)。

    目前國際上推薦使用和報(bào)道的MA檢測方法較多,但除了本研究外僅檢索一篇Melanie Broszat等用TLC建立MA定量檢測方法的報(bào)道,但展開劑與本研究完全不同,檢出限也僅為30 mg/kg水平[6]。TLC在色譜家族使用范圍最寬,因此被譽(yù)為“萬能色譜法”,但相對其他后來發(fā)展的色譜方法,TLC靈敏度低、在接近檢測極限時(shí)重復(fù)性、穩(wěn)定性較差。這可能也是眾多開發(fā)者沒有選擇TLC來建立MA檢測方法的原因。本研究組在2009年初獨(dú)立研究建立了TLC檢測MA方法,但因檢出限與2008年國家臨時(shí)制定的MA監(jiān)控限量(2.5~1.0 mg/kg)[7]差距太大而未作報(bào)道,并一度中斷研究實(shí)驗(yàn)。隨著對“現(xiàn)代薄層層析法”和“高效薄層層析(HPTLC)”潛能認(rèn)識的加深,我們重新調(diào)整思路,在大量實(shí)驗(yàn)中找到了一種提高TLC法檢測MA靈敏度的關(guān)鍵原理——濃縮展開原理,并獲得了初步實(shí)效。但眾所周知,薄層板材料、型號和展開劑理化性質(zhì)的變化以及這兩者的交互作用變化十分敏感,因此本研究建立的方法在穩(wěn)定性、重復(fù)性方面仍需做較多的實(shí)驗(yàn),并完善MA的HPTLC定量分析方案。后續(xù)研究將另行報(bào)道。

    本研究證明,HPTLC檢測MA是完全可行的,而且靈敏度還有望優(yōu)化提高。與目前國家推薦的3種方法[1-3]相比,用該方法進(jìn)行定性或半定量檢測無需特殊儀器、樣品前處理簡單,檢測效率高,無疑會成為一種高通量、檢測成本低廉的MA檢測方法,尤其適合在企業(yè)進(jìn)行大批量原奶、奶粉及其他原料、輔料和添加劑的高通量檢驗(yàn)和篩選檢驗(yàn),適合監(jiān)控意外嚴(yán)重污染的突發(fā)。

    [1]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

    [2]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

    [3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).NY/T 1372-2007飼料中三聚氰胺的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007.

    [4]何麗一.平面色譜方法及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2005:29.

    [5]侯曼玲.食品分析[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:211.

    [6]MELANIE B,REGINA B,BERND S.A New Method for Quantification of Melamine in Milk by Absorption Diode-Array Thin-Layer Chromatography[J].Journal of Planar Chromatography,2008,21(6): 469-470.

    [7]中華人民共和國衛(wèi)生部2008年10月08日.衛(wèi)生部發(fā)布會介紹三聚氰胺臨時(shí)管理限量值規(guī)定等[N/OL].中央政府門戶網(wǎng)站.http://www. gov.cn/xwfb/2008-10/08/content_1115170.htm.

    Preliminary establishment of a high sensitivity melamine determination method by HPTLC

    MENG Lan-huan,LIU Xing-kai,GUO Jun
    (Food Science and Engineering College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

    To develop low-cost and high throughput method for melamine(MA)determination in milk and dairy product,a sensitive high performance thin layer chromatographic(HPTLC)method was initially established.MA concentrated during developing on plate.On a high performance silica gel G plate(domestic product),with tetrahydrofuran,water and acetic acid as the basic developing agent,Chlorine and iodine/starch reagent applied as staining reagent,the detection limit reached 5.0~2.5 mg/L,even reached 1.0~0.5 mg/L level in optimized experiment.Obviously HPTLC can be use to build an inexpensive,easy operating and high efficient MA residues detection.

    Melamine,HPTLC,milk

    TS252.7

    A

    1001-2230(2011)06-0060-02

    2011-03-01

    孟蘭環(huán)(1984-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。通訊作者:郭軍

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