動物源性成分分子生物學檢測技術研究進展

陳基耘

廣東省珠海市質量計量監(jiān)督檢測所（珠海 519002）

近年來，食品安全問題日益突出，不法分子利用廉價肉摻入高價肉中，從而獲取巨額利潤。在我國，肉羊是畜牧業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，消費需求旺盛。然而，用雞、鴨和豬肉摻入或者替代羊肉的事件屢見不鮮。這些事件的出現(xiàn)嚴重干擾了我國畜肉產(chǎn)業(yè)，損害了消費者的權益，制約了肉品質量的提升甚至產(chǎn)生了宗教信仰相關的問題。隨著不法商販的造假手段日益翻新，肉制品質量安全的復雜性也逐漸增加，因此，傳統(tǒng)的鑒別技術已經(jīng)不能滿足市場監(jiān)管的需求。準確、高效、快速的多種動物源性成分檢測技術的開發(fā)，不僅能使消費者的權益得到保障，也是監(jiān)管部門工作的技術支持。目前，國內(nèi)外已經(jīng)研究出多種檢測方法，常見的肉制品鑒別方法包括形態(tài)學、代謝組學、光譜學和基因組學方法等。形態(tài)學主要依賴光學顯微鏡技術和數(shù)據(jù)圖像分析像結合進行鑒定；光譜學盡管分析速度較快，但是通常需要對大量樣品進行建模，而且通用性不強；蛋白質組學鑒定技術包括電泳、化學技術和免疫學方法等。由于蛋白質結構容易受溫度、微生物污染、抗原交叉、反應剪切力等多種因素影響，對儀器、試劑和樣品處理要求高，存在復雜、昂貴、費時且缺乏特異性等問題，因此，蛋白質鑒定技術的可靠性和穩(wěn)定性較差，并不能很好地滿足摻假肉檢測的需求。近年來，以核酸分子鑒定技術為主的生物學鑒定方法由于其靈敏度高、特異性強和準確度高等優(yōu)點，已成為國際上肉類源性成分鑒別的主流技術。核酸分子鑒定能夠克服蛋白鑒定方法的不足，具有基質干擾小、易于操作和保存、鑒定成本相對較低等優(yōu)點，適宜在檢測機構實驗室中應用與推廣。因此，基于上述技術優(yōu)勢，文章對肉與肉制品中多種動物源性成分鑒定相關技術進行介紹并進行展望，以期為監(jiān)管機構、檢測機構的肉與肉制品安全監(jiān)督提供技術參考。

1 PCR技術

PCR技術又稱為聚合酶鏈技術（PCR），目前，國內(nèi)外進行多種動物源性成分鑒定的常用PCR技術包括多重PCR[1-3]、實時熒光定量PCR[4-6]、限制性片段長度多態(tài)性PCR[7-9]等。這些技術主要是通過在常規(guī)PCR技術基礎上加入熒光染料或標記探針，根據(jù)熒光信號的累積對反應過程進行實時監(jiān)控，以實現(xiàn)對起始模板的精確定量和定性分析。自2007年以來，我國也陸續(xù)頒布了一系列以PCR技術為主的國家標準[10-13]，以滿足動物源性成分鑒定的檢測和監(jiān)管需求。但是這些標準大多只用于定性鑒定，未進行定量分析。

多重PCR技術，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR相同。如Iwobi等[14]選擇β-肌動蛋白基因和肌肉生長抑制素基因為分析對象，設計引物和Taqman探針，采用三重PCR用于定性和定量檢測混合肉中牛源性和豬源性成分。多重PCR技術因其靈敏度高、檢測效率高的特點，目前已被廣泛應用于多種動物源性成分的同時鑒定，但該技術因在同一反應中投入了多對引物，易引起交叉反應。

熒光定量PCR技術，熒光試劑的使用包括熒光探針或者熒光染料。因所使用熒光試劑的不同，可分為特異類和非特異類兩類。特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物。而非特異性檢測方法是在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。這些技術亦被廣泛應用于肉類摻假的鑒定，Kang等[15]采用Subr Green染料，在100%~0.01%范圍內(nèi)對豬肉和牛肉混合樣品中豬肉的含量進行測定，用于檢測牛肉加工制品中是否有豬肉摻假。

限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PCRRFLP）技術，是用特異設計的PCR引物擴增目標材料時，由于特定位點的堿基突變、插入或缺失數(shù)很少，以至無多態(tài)出現(xiàn)，往往需要對相應PCR擴增片段進行酶切處理，以檢測其多態(tài)性。如Uddin等[16]建立了牛、水牛、雞、鴨、山羊、綿羊和豬的七重PCR-RFLP檢測方法，用于生鮮肉及加工肉制品中目標物種的鑒別。然而，該技術使用內(nèi)切酶，這無形中增加了研究成本，限制了該技術的廣泛應用。

數(shù)字PCR是近年來發(fā)展起來的一種核酸分子絕對定量技術。20世紀末，Vogelstein等[17]提出數(shù)字PCR的概念，通過將一個樣本稀釋并分成幾百到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含最多一個拷貝的DNA模板，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計分析。如Ren等[18]采用微滴數(shù)字PCR定量測定綿羊和山羊肉產(chǎn)品中雞肉的含量，并在檢驗過程中將動物源成分質量比例轉換為拷貝數(shù)的比例，結果表現(xiàn)出良好的重復性和穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的PCR、熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR在定量上不依賴擴增閾值（Ct值），表現(xiàn)出更高的準確度和靈敏度，但是該技術通常使用芯片完成，檢測成本偏高，試驗對操作人員及設備環(huán)境的要求較高，因此難以在基層檢測機構中普及。

2 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）是Notomi等[19]早在2000年建立的一種新型的等溫擴增方法。與傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應（PCR）相比，LAMP技術可以在恒溫狀態(tài)下完成反應而不需要在精密的控溫設備中對目標模板進行反復的熱變性，通常在0.5~1 h內(nèi)就可以實現(xiàn)目標序列進行109倍的連續(xù)快速擴增。伴隨著DNA片段混合物的生成，大量的白色焦磷酸鎂沉淀生成，通過用SYBR green對DNA片段產(chǎn)物進行熒光染色或者對焦磷酸鎂生成后溶液的濁度進行分析，即可用肉眼或者儀器判斷樣本中是否含有目標鏈?；谏鲜鯨AMP檢測技術原理的特殊性，該技術擺脫了復雜的精密儀器的限制，能滿足現(xiàn)場檢測及執(zhí)法的需求，結果肉眼可判別，因此被應用于肉類快速檢測中。如Cai等[20]研發(fā)了一種可在20 min內(nèi)檢測出肉制品中豬源成分的實時環(huán)介導等溫擴增的測定法，這也是首次應用LAMP法檢測商業(yè)產(chǎn)品中的豬源成分。Zahradnik等[21]采用LAMP法檢測加工食品中馬肉含量，能從制備的香腸中檢測到0.1%的馬肉。

3 DNA分子雜交技術

DNA分子雜交的基礎是具有互補堿基序列的DNA分子，可以通過堿基對之間形成氫鍵等形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。在進行DNA分子雜交前，先要將兩種生物的DNA分子從細胞中提取出來，再通過加熱或提高pH的方法，將雙鏈DNA分子分離成為單鏈，這個過程稱為變性。然后，將兩種生物的DNA單鏈放在一起雜交，其中一種生物的DNA單鏈事先用同位素進行標記。如果兩種生物DNA分子之間存在互補的部分，就能形成雙鏈區(qū)。由于同位素被檢出的靈敏度高，即使兩種生物DNA分子之間形成百萬分之一的雙鏈區(qū)，也能夠被檢出。這種技術很早就被應用于肉類檢測中，如Buntjer等[22]建立了牛、羊、馬、雞、豬等多種物種的分子雜交檢驗方法，在混合肉中可以檢測到最低1%的目標肉，并且對于熱加工的樣品依然具有很好的檢測效果。然而，該技術DNA雜交技術作為一種基礎的檢測技術，也存在靈敏度低、耗時長等缺陷。

4 DNA條形碼技術

DNA條形碼技術是利用生物體DNA中一段保守片段對物種進行快速準確鑒定的新興技術。DNA條形碼（DNA barcode）是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段。在發(fā)現(xiàn)一種未知物種或者物種的一部分時，研究人員便描繪其組織的DNA條形碼，而后與國際數(shù)據(jù)庫內(nèi)的其他條形碼進行比對。如果與其中一個相匹配，研究人員便可確認這種物種的身份?，F(xiàn)今大部分動物采用COI基因作為條形碼標準片段[23]。目前，基于DNA條形碼技術的研究主要集中在水產(chǎn)品鑒別領域，如：李新光等[24]利用DNA條形碼技術對15種烤魚片進行鑒定，結果發(fā)現(xiàn)僅有一種烤魚片與標識相符，存在大量的造假行為；Carde?osa等[25]在廣州的市場上采購了200種鯊魚魚鰭，這些魚鰭中只有0.5%含有完整的COI序列。

5 展望

隨著人民生活水平的提高，群眾對生活品質特別是食品安全的關注一直是近年來的熱點。快速、準確地檢測肉類源性成分，是我們迫切需要解決的問題。基于分子生物學原理的檢測技術，因其低廉、高效、靈敏的優(yōu)勢，已成為目前國內(nèi)外相關領域檢測的主流技術。但是，目前的檢測技術在精準定量方面，效果仍不盡人意，難以解決有意摻假和無意摻假等執(zhí)法監(jiān)管難題。為此，針對以上窘?jīng)r，開展針對性的研究，才能為科學執(zhí)法提供更準確可靠的技術支持。

6 結語

綜上所述，以分子生物學為基礎的檢測技術種類豐富，其靈敏度高、特異性強及操作簡單的特點，自問世以來倍受青睞，在檢測領域擁有很高的應用價值。但基于分子生物學的檢測技術應用于肉類摻假檢測領域仍存在一些挑戰(zhàn)。比如，熒光染料與DNA雙鏈的非特異性結合或者體系中存在與靶基因同源的序列都可能會影響結果的準確性。隨著分子生物學檢測技術的飛速發(fā)展，新型熒光標記物的設計及新型檢測模式的深入探索，在肉類摻假檢測領域，快速準確、低成本、高通量的檢測技術將指日可待。