RAPD分子標(biāo)記對(duì)藥用植物大花紅景天瀕危原因分析

徐進(jìn)，陳新，彭成

大花紅景天(R.crenmulata.H.Ohba)是《中華人民共和國(guó)藥典2005版》收錄的唯一紅景天的藥用品種。主要分布于四川川西高原的阿壩州和甘孜州，以及西藏的廣大地區(qū)。生長(zhǎng)在海拔4500 m－5000 m的高山頂上。由于它具有適應(yīng)原樣性作用，以及治療心血管疾病等諸多方面的藥理活性，而一度成為研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。隨著大花紅景天資源儲(chǔ)量的日益減少，保護(hù)這種珍貴的藥用植物，使其達(dá)到可持續(xù)的開發(fā)和利用，就成為了大花紅景天研究的重要內(nèi)容。對(duì)大花紅景天種群遺傳多樣性的深入研究將有助于我們了解其瀕危的可能原因，指導(dǎo)更好的制定保護(hù)政策。

隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(random amplified polymorphic DNA，RAPD)可直接反映生物體內(nèi) DNA分子水平上的多態(tài)性，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性的分析，親緣關(guān)系分析以及品種鑒定等方面的研究。一個(gè)物種的消失與否一部分取決于其遺傳多樣性的水平。利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究不同產(chǎn)地大花紅景天的遺傳多樣性，將有助于從分子層面探究其瀕危的可能原因。指導(dǎo)我們對(duì)這種珍貴的藥用植物資源進(jìn)行有效的保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集不同海拔高度的五個(gè)產(chǎn)地的大花紅景天幼嫩葉片，用變色硅膠干燥保存。材料具體來(lái)源見表1。

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1.2 儀器與試劑

CTAB(美國(guó)Sigma公司);Tirs(上海生工);EDTA(上海生工);Taq 酶(dNTP，10 ×buffer，Mg2+)(大連寶生物生命科技公司);Goldview染料(北京賽百盛生物工程公司);DNA Maker15000，DNA Maker2000(大連寶生物生命科技公司);RAPD隨機(jī)引物(北京賽百盛生物工程公司);瓊脂糖(美國(guó)sigma公司);PCR儀(美國(guó)貝克曼公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)貝克曼公司);恒壓恒流電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.3 大花紅景天DNA的提取

采用改良的CTAB法提?。?］，取約100mg干燥的葉片于研缽中－70℃冷凍過(guò)夜，取出后迅速研磨成細(xì)粉，加入 700μL2%CTAB于金屬浴上 65℃保溫45min，期間振搖2－3次。取出放至室溫加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)抽提兩次，10000 r·min－1離心10min。吸取上清液加入體積異丙醇沉淀DNA，－20 ℃保存60min，取出室溫解凍，10000 r·min－1離心10min，用80%乙醇清洗沉淀兩次，室溫?fù)]干至無(wú)醇味。100μL超純水37℃溶解DNA，加入0.01g/mL的 RnaseA 2μL，37 ℃保溫 30min。加入400μL 超純水后，用等體積氯仿/異戊醇抽提1次，吸取上清夜加入體積的異丙醇沉淀DNA，－20℃保存60min，取出室溫解凍，10000 r·min－1離心10min，用80%乙醇清洗沉淀2次，室溫?fù)]干至無(wú)醇味，100μL超純水37℃溶解DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大花紅景天RAPD反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)PCR擴(kuò)增的主要影響因素包括DNA模板濃度，隨機(jī)引物濃度，dNTP濃度，Mg2+濃度，Taq酶用量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化［2，3］，單因素優(yōu)化退火溫度以及循環(huán)次數(shù)，最終確定的PCR反應(yīng)參數(shù)是:反應(yīng)總體積20μL，ddH2O 11.1μL;DNA 模板 1.5μL，隨機(jī)引物(1mmol/l)1μL;dNTP(0.25mmol/l)2μL;Mg2+(2.5mmol/l)2μL;Taq 酶(5u/μl)0.4μL;上覆蓋20μL礦物油。

擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min，然后再按94℃變性1min，37℃退火1min，72℃延伸1.5min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸4min

反應(yīng)產(chǎn)物在1.4瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，自動(dòng)成像儀照相并保存。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)電泳后按瓊脂糖凝膠同一位置上DNA條帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶包括弱帶記為“1”無(wú)帶記為“0”構(gòu)建RAPD原始數(shù)據(jù)，采用RAPDdistancel.04軟件包計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率，遺傳距離以及構(gòu)建親緣關(guān)系樹系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD隨機(jī)引物的篩選

以其中一個(gè)產(chǎn)地大花紅景天的DNA為模板，對(duì)40條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，初步篩選后有16條隨機(jī)引物，用這16條隨機(jī)引物對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的大花紅景天進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有12條引物對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的大花紅景天均可擴(kuò)增出清晰且穩(wěn)定的DNA條帶，這12條隨機(jī)引物的名稱及堿基序列見表2。

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2.2 不同產(chǎn)地大花紅景天DNA的多態(tài)性分析

用篩選出的12條隨機(jī)引物對(duì)5個(gè)產(chǎn)地的大花紅景天的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果12條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出99條DNA帶，其中79條DNA條帶顯示出多態(tài)性，占總條帶的79.9%。不同隨機(jī)引物擴(kuò)增出的DNA條帶數(shù)差異較大，結(jié)果見表3。12條隨機(jī)引物擴(kuò)增出的DNA條帶數(shù)在5－12條之間，平均每條隨機(jī)引物擴(kuò)增出8.25條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶6.66條，占其中的80.7%

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圖1 大花紅景天總DNA提取

2.5 各產(chǎn)地大花紅景天的遺傳距離及聚類分析

采用RAPDdistance1.04統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)RAPD分析后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳距離的計(jì)算，結(jié)果見表4;構(gòu)建的親緣關(guān)系樹系圖，見圖2。

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遺傳距離的大小反應(yīng)了親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，遺傳距離越大表明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，反之，遺傳距離越小則親緣關(guān)心越近。從遺傳距離矩陣的結(jié)果可以看出:5個(gè)大花紅景天居群的遺傳距離在0.4784－0.7774之間。其中馬爾康和康定兩個(gè)產(chǎn)地大花紅景天的遺傳距離最小為0.4784，表明二者的親緣關(guān)系最近。紅原和林芝的遺傳距離最大為0.7774，表明二者的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。

圖2 大花紅景天不同產(chǎn)地的聚類樹系圖

基于遺傳相似系數(shù)構(gòu)建的親緣關(guān)系樹系圖顯示，首先是馬爾康和康定居群聚在一起，其次是與紅原居群相聚，再與小金居群相聚，最后和林芝居群聚類在一起。這也符合川西高原與西藏在地理上有一定距離的間隔，西藏那曲居群作為一個(gè)獨(dú)立的居群最后才與其他居群相聚。

3 討論

多態(tài)位點(diǎn)百分率可以做為度量遺傳多樣性高低的指標(biāo)。［4］大花紅景天的多態(tài)位點(diǎn)百分率表明，大花紅景天具有較高的遺傳多樣性。在考慮到其惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境以及相對(duì)狹窄的分布區(qū)，可以說(shuō)大花紅景天的遺傳多樣性是十分豐富的。

遺傳距離越大，說(shuō)明居群之間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。通過(guò)RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析得到的大花紅景天的遺傳距離表明大花紅景天五個(gè)居群的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這可能是因?yàn)楦骶尤褐g的空間間隔較大，不易進(jìn)行居群間的遺傳信息交流所致。

一般認(rèn)為物種的瀕危主要原因是遺傳多樣性的降低，而遺傳多樣性的單一會(huì)導(dǎo)致適應(yīng)外界環(huán)境能力的下降，因此就很容易受到生境改變的影響，一但生境發(fā)生變故，該物種相對(duì)就易于導(dǎo)致滅絕。［5］通過(guò)研究表明，大花紅景天的遺傳多樣性十分豐富，因此可以初步認(rèn)定其瀕危的可能原因是由于人為因素造成的，故挽救大花紅景天首先應(yīng)該改善該物種所面臨的人為破壞的確定性威脅。

雖然大花紅景天是進(jìn)行有性生殖的植物，其有利于各居群進(jìn)行遺傳信息的交流，但大花紅景天的自身生物學(xué)特性就一定程度的促使了其瀕危，大花紅景天的花粉和孢子的自身特點(diǎn)都不利于其傳粉和受精;且生長(zhǎng)環(huán)境十分惡劣，傳粉昆蟲就相對(duì)較少，其生長(zhǎng)的流石灘土壤層又比較稀薄，不利于種子生根發(fā)芽;繁育期雨量較大，晴好天氣較少，致使花粉傳播受限。以上都一定程度的影響了該物種居群的繁殖和擴(kuò)增。

通過(guò)RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)大花紅景天遺傳多樣性的分析，以及根據(jù)其自身的生物學(xué)特性，提出就地保護(hù)的保護(hù)措施，即實(shí)施保護(hù)區(qū)保護(hù)。大花紅景天自身具有豐富的遺傳多樣性，在解除了人為破壞的威脅下，居群能夠?qū)崿F(xiàn)自身的更新，人為增加保護(hù)區(qū)昆蟲的數(shù)量，促使大花紅景天居群間遺傳信息的交流，以減少居群間的空間隔離效應(yīng)，從而增加有效居群的大小，改善小居群因基因交流少而衰退，以及遺傳變異的喪失。

實(shí)現(xiàn)對(duì)大花紅景天這一瀕危的藥用植物的有效保護(hù)，令其可持續(xù)的發(fā)展，就能夠更好的為人類造福。

［1］藍(lán)云龍，吳令上，裘波音，等.魚腥草RAPD分子標(biāo)記的多態(tài)性［J］.浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，25(3):309.

［2］陳少瑜，楊恩，張雨，等.云南核桃品種遺傳多樣性的RAPD和ISSR 標(biāo)記研究［J］.河北林果研究，2007，(1):22.

［3］宋書娟，李雅軒，郭平仲，等.RAPD分子標(biāo)記與群體遺傳多態(tài)性分析［J］.首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000，21(2):52.

［4］張文彪，金則新，李均敏.不同生境夏臘梅群體遺傳多樣性的 RAPD 分析［J］.植物研究.2007，27(3):313.

［5］ZHANG Ren － Bo，DOU Quan － Li，HE Ping.Analysis of genetic diversity in thuja sutchuenensis populations as revealed by morphological and molecular data［J］.Guihaia，2007，27(5):687.