針刺足三里、關(guān)元穴對(duì)膿毒癥大鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響

郭小文 朱美飛 徐勇剛 雷 澍

浙江省中醫(yī)院（杭州 310006）

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)和感染后常見(jiàn)并發(fā)癥,其本質(zhì)為不同感染性因素所致失控性炎性反應(yīng)。細(xì)菌、真菌、病毒及其毒性產(chǎn)物等均可誘發(fā)本病。臨床流行病學(xué)資料顯示,膿毒癥是危重癥患者的主要死亡原因之一,現(xiàn)已成為進(jìn)一步提高危重癥救治成功率的最大障礙。膿毒癥患者常伴有免疫抑制，是膿毒癥預(yù)后差的主要原因，同時(shí)膿毒癥免疫抑制與淋巴細(xì)胞凋亡加速關(guān)系密切[1]。減輕膿毒癥的淋巴細(xì)胞凋亡不但能提高免疫功能，而且能改善預(yù)后。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，針刺足三里、關(guān)元穴能提高機(jī)體免疫功能，但其機(jī)制尚未完全闡明。本研究以盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）致腹腔感染膿毒癥大鼠為模型，研究電針足三里、關(guān)元穴對(duì)胸腺細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD健康大白鼠(由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量200～250g，雌雄各半。（2）主要設(shè)備與儀器：G6805－A型電針治療儀由上海醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)，AnnexinⅤ－PI雙染試劑盒購(gòu)自羅氏公司，血管活性腸肽 (VIP）放免試劑盒由北京?？其J生物制品有限公司提供，Epics－profile型流式細(xì)胞儀由美國(guó)Coulter公司生產(chǎn)。

1.2 方法 （1）分組及造模：應(yīng)用分段隨機(jī)分組法將大鼠分為3組(每組12只）：正常對(duì)照組、模型組、針刺組。大鼠以鹽酸氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉后，作1～2cm長(zhǎng)的腹正中切口。游離出盲腸并用30號(hào)絲線結(jié)扎，以22G針頭于盲腸穿刺2處，并擠出小量腸內(nèi)容物以保持穿刺孔開(kāi)放。還納腸管，以絲線縫合關(guān)腹。術(shù)畢皮下注射生理鹽水2mL。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均在安靜環(huán)境下統(tǒng)一喂養(yǎng)。針刺組每日針刺足三里穴，進(jìn)針5～7mm，關(guān)元穴進(jìn)針3～5mm，通電留針30min，采用連續(xù)波，頻率3次/s，強(qiáng)度以針柄顫動(dòng)，但能使動(dòng)物不掙扎嘶叫，保持安靜為度。定位取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[2]。針刺組于術(shù)后復(fù)蘇成功后分別于即刻、12h和24h行電針治療。正常對(duì)照組與膿毒癥模型組大鼠每日相同時(shí)刻以同樣方法固定30min，但不行電針刺激。（2）標(biāo)本采集及測(cè)定：所有大鼠于術(shù)后36h處死，收集標(biāo)本進(jìn)行凋亡檢測(cè)。光學(xué)顯微鏡和透射電鏡下觀察胸腺形態(tài)學(xué)改變。Annexin－PI雙染色法標(biāo)記，網(wǎng)搓法分離胸腺細(xì)胞，將細(xì)胞收集到試管，PSB洗2次，離心棄上清液，懸浮沉淀的細(xì)胞，取50μL細(xì)胞懸液(含細(xì)胞數(shù)5×105～1×1010個(gè)）加入試管中，同時(shí)試管中加入1μL AnnexinVFITC試劑及5μL PI(0.25g/L）溶液，4℃下避光反應(yīng)，10min后加冷緩沖液400μL，30min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。（3）腦垂體和外周血中VIP含量：采血2mL，125kU/mL肝素抗凝。應(yīng)用放射免疫分析法 (RIA）測(cè)定腦垂體和外周血中VIP含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用One－Way ANOVA統(tǒng)計(jì)方法。計(jì)量資料以(）表示。

2 結(jié)果

2.1 各組胸腺細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 （1）光鏡觀察結(jié)果：正常對(duì)照組胸腺組織學(xué)所見(jiàn)基本一致，胸腺無(wú)明顯病理改變，胸腺細(xì)胞密集分布于胸腺皮質(zhì)，細(xì)胞核呈圓形，深藍(lán)色著染，胞質(zhì)少，凋亡小體少見(jiàn)；核較大而著色淺的上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞散在于其間。過(guò)渡到胸腺髓質(zhì)后，胸腺細(xì)胞數(shù)目明顯減少，逐漸以上皮性網(wǎng)狀細(xì)胞為主。CLP后36h各組大鼠胸腺皮質(zhì)細(xì)胞稀疏，而髓質(zhì)區(qū)細(xì)胞無(wú)明顯減少，細(xì)胞分布反而較皮質(zhì)區(qū)密集。皮質(zhì)區(qū)凋亡細(xì)胞增多，核染色質(zhì)濃縮、固縮，可見(jiàn)吞噬細(xì)胞碎片和凋亡小體的巨噬細(xì)胞。（2）透射電鏡觀察結(jié)果：正常對(duì)照組胸腺皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)許多淋巴細(xì)胞，表面光滑，核大胞漿少，胞內(nèi)細(xì)胞器少，線粒體無(wú)腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，細(xì)胞核密度高。CLP致腹腔感染各組大鼠胸腺的淋巴細(xì)胞與上皮網(wǎng)狀細(xì)胞均遭到不同程度的破壞。凋亡的胸腺淋巴細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞器增殖的凋亡細(xì)胞胞體變大，胞體內(nèi)充滿增殖的細(xì)胞器，以線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主；細(xì)胞器不增殖的凋亡細(xì)胞體皺縮，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，核漿比例減少，核固縮，核染色質(zhì)固縮成新月形或塊狀，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、增多。晚期細(xì)胞核崩裂為多個(gè)小球形塊，經(jīng)細(xì)胞膜出芽形成多個(gè)凋亡小體。

2.2 各組大鼠胸腺淋巴細(xì)胞凋亡率比較 見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比，模型組和針刺組36h后大鼠胸腺細(xì)胞凋亡率均明顯升高，(P＜0.05）；與模型組相比，針刺組胸腺細(xì)胞凋亡率明顯降低(P ＜ 0.05）。

表1 各組胸腺細(xì)胞凋亡率、外周血和腦垂體中VIP含量比較 (）

表1 各組胸腺細(xì)胞凋亡率、外周血和腦垂體中VIP含量比較 (）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01

組 別n 凋亡淋巴細(xì)胞比例（%）腦垂體VIP含量（ng/L）外周血VIP含量（ng/L）539.60±34.50 335.60±27.30*433.10±52.90*△△20.10±2.20 43.60±3.20*31.50±3.20*△12 12 12正常對(duì)照組模型組針刺組22.30±1.50 12.30±1.30*16.20±1.20*△△

2.3 各組外周血和腦垂體中VIP含量變化 模型組和針刺組大鼠外周血和腦垂體中VIP含量均明顯低于正常對(duì)照組 (P＜0.05）；但針刺組外周血和腦垂體中VIP含量均明顯高于模型組(P ＜ 0.05），見(jiàn)表 1。

3 討論

近年來(lái)隨著膿毒癥致病機(jī)制和宿主對(duì)膿毒癥反應(yīng)基因?qū)W基礎(chǔ)研究的不斷深入，人們對(duì)膿毒癥的病理生理機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，已認(rèn)識(shí)到機(jī)體免疫狀態(tài)紊亂在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者往往伴有免疫抑制，包括遲發(fā)高反應(yīng)的消失，清除感染的障礙和院內(nèi)感染的發(fā)生率高，目前認(rèn)為這是膿毒癥治療成功率低的重要原因。近年來(lái)得益于基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，膿毒癥免疫抑制發(fā)生的機(jī)制正逐步闡明。目前認(rèn)為膿毒癥免疫抑制與淋巴細(xì)胞凋亡加速關(guān)系密切。大量研究證實(shí)了淋巴細(xì)胞在本癥發(fā)展中發(fā)生了凋亡[3,4]。本研究中，光鏡和電鏡證實(shí)在CLP 36h后各組胸腺細(xì)胞凋亡增多，胸腺細(xì)胞凋亡率明顯升高。膿毒癥時(shí),由于細(xì)菌及內(nèi)毒素的不斷入侵,T淋巴細(xì)胞在受到外來(lái)抗原刺激后被激活,當(dāng)出現(xiàn)異常的活化信號(hào)或非特異性的損傷時(shí)可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的凋亡。雖然淋巴細(xì)胞對(duì)外界的刺激異常敏感是細(xì)胞自身的一種保護(hù)機(jī)制,但淋巴細(xì)胞的過(guò)度凋亡會(huì)削弱抗體的產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞的激活和抗原的遞呈能力,繼而直接和間接損害免疫功能,最終導(dǎo)致免疫抑制,減弱機(jī)體抗感染能力。膿毒癥時(shí)，大量淋巴細(xì)胞凋亡是機(jī)體重要的應(yīng)激反應(yīng)，這種反應(yīng)使許多生理?xiàng)l件下應(yīng)該被淘汰的細(xì)胞不致由于膿毒癥時(shí)免疫功能的紊亂而被錯(cuò)誤地保留。研究發(fā)現(xiàn)，死亡的膿毒癥患者中，其外周血淋巴細(xì)胞Bcl－2表達(dá)明顯下降，凋亡的淋巴細(xì)胞明顯增加[5]。膿毒癥患者尸檢研究也顯示，許多參與獲得性免疫反應(yīng)的炎癥細(xì)胞凋亡增加。研究發(fā)現(xiàn)抑制淋巴細(xì)胞異常凋亡可明顯改善膿毒癥的預(yù)后。Hotchkiss等[6]證實(shí)TAT－BH4和TAT－Bcl－xL縮氨酸能減輕膿毒癥誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡并改善預(yù)后。Chung等[7]報(bào)道Fas－L缺陷膿毒癥模型鼠黏膜B淋巴細(xì)胞凋亡減少且生存率提高；Schwulst等[8]發(fā)現(xiàn)使用競(jìng)爭(zhēng)性CD40受體單克隆抗體能減少淋巴細(xì)胞凋亡，進(jìn)而明顯改善膿毒癥預(yù)后。因此，膿毒癥時(shí)糾正淋巴細(xì)胞異常凋亡已成為治療膿毒癥的新方向。

近年來(lái)一些臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)針灸對(duì)免疫功能有增強(qiáng)作用。雖然研究結(jié)果存在差異，但結(jié)果均證實(shí)，針灸對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙向良性調(diào)節(jié)作用，包括對(duì)白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞免疫均有促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用。陳永等[9]發(fā)現(xiàn)針灸足三里、關(guān)元等強(qiáng)壯要穴可以顯著提高機(jī)體的免疫功能。謝延等[10]發(fā)現(xiàn)艾灸關(guān)元、足三里可在一定程度上改善衰老機(jī)體的免疫衰退或紊亂情況，增強(qiáng)免疫器官功能；提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,從多個(gè)途徑增強(qiáng)或改善機(jī)體免疫功能。袁民等[11]發(fā)現(xiàn)艾灸中脘、神闕、關(guān)元穴能提高荷瘤小鼠的免疫力，提高CD3、CD4、CD4/CD8比率、NK細(xì)胞、LAK等細(xì)胞殺傷活性。高洪泉等[12]發(fā)現(xiàn)針刺足三里、關(guān)元能提高單核巨噬系統(tǒng)的吞噬功能，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)免疫功能的效果。

本研究通過(guò)電鏡和光鏡胸腺病理組織學(xué)和AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)胸腺細(xì)胞凋亡率證實(shí)電針足三里、關(guān)元穴能減輕膿毒癥大鼠胸腺細(xì)胞的凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與電針足三里、關(guān)元穴使膿毒癥大鼠腦垂體和外周血中VIP的合成和釋放增多有關(guān)。本研究為臨床進(jìn)一步應(yīng)用針灸調(diào)節(jié)膿毒癥患者的免疫功能提供了新的手段和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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