SARS 3CL蛋白酶同源二聚化與底物結(jié)合互為別構(gòu)調(diào)控因素

魏 平 李春梅 周 璐 劉 瑩 來魯華,*

(1北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)國家重點實驗室,北京分子科學(xué)國家實驗室,北京 100871; 2北京大學(xué)理論生物學(xué)中心,北京 100871)

SARS 3CL蛋白酶同源二聚化與底物結(jié)合互為別構(gòu)調(diào)控因素

魏 平1,2李春梅1,2周 璐1劉 瑩1來魯華1,2,*

(1北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)國家重點實驗室,北京分子科學(xué)國家實驗室,北京 100871;2北京大學(xué)理論生物學(xué)中心,北京 100871)

研究了嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)冠狀病毒3C-Like蛋白酶(3CLpro)在存在底物或抑制劑時的二聚體形成情況.通過測定酶活性隨酶濃度的變化,擬合出在底物存在下酶二聚體的解離常數(shù)約為0.94 μmol·L-1,小于純蛋白酶的二聚體解離常數(shù)(14.0 μmol·L-1),表明底物對二聚體的形成具有增強作用.選用與底物具有類似結(jié)合方式的靛紅類抑制劑N-萘甲基靛紅-5-甲酰胺(5f),利用超速離心沉降速率方法定量測定了SARS 3CL蛋白酶單體和二聚體在不同濃度5f時的含量,發(fā)現(xiàn)5f同樣具有誘導(dǎo)二聚體形成的能力.在3 μmol·L-1蛋白酶濃度下測定得到誘導(dǎo)二聚的EC50值(半數(shù)有效濃度)約為1 μmol·L-1,說明二聚體中只有一個單體與抑制劑結(jié)合.研究結(jié)果表明,隨著底物濃度的升高,SARS 3CL蛋白酶會形成更多的二聚體,而二聚體含量的提高又反過來提高酶的活性,這種雙向別構(gòu)調(diào)控機制有可能是病毒用來調(diào)控多聚蛋白水解速率和組裝時機的一種方法.

別構(gòu)效應(yīng);SARS;3CL蛋白酶;分析型超速離心;底物增強的酶二聚化

嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)冠狀病毒3CL蛋白酶是病毒復(fù)制周期中的關(guān)鍵酶.由于該蛋白酶在人類細胞中沒有同源分子,針對其設(shè)計的藥物不易產(chǎn)生毒副作用[1].同時由于其在病毒復(fù)制中的突變率低,能夠避免病毒突變過快形成的抗藥性,因此被普遍認為是基于結(jié)構(gòu)的抗SARS及其它由冠狀病毒引發(fā)疾病藥物設(shè)計的重要靶標(biāo)[2-3].SARS冠狀病毒3CL蛋白酶與其他幾種冠狀病毒3CL蛋白酶的序列相似程度很高.其三維結(jié)構(gòu)與另外兩種已知的冠狀病毒3CL蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)基本相同,都含有三個結(jié)構(gòu)域[2,4].N端兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了催化結(jié)構(gòu)域,其結(jié)構(gòu)類似于絲氨酸蛋白酶,起催化作用的氨基酸殘基位于這兩個結(jié)構(gòu)域間形成的裂隙中[2,5-6].C端的結(jié)構(gòu)域是一個以α-螺旋為主的結(jié)構(gòu)域.研究表明冠狀病毒3CL蛋白酶在溶液中能夠形成二聚體,C結(jié)構(gòu)域?qū)τ诙垠w的形成至關(guān)重要[7-9].

在生物系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)極少以獨立的角色參與生命活動,往往是通過與其它分子結(jié)合形成大分子復(fù)合物的方式來實現(xiàn)各種功能的,其中相當(dāng)部分是相同蛋白質(zhì)分子間所形成的同源二聚或多聚體.在Brenda酶數(shù)據(jù)庫(http://www.brenda.uni-koeln.de)中452個列出亞基構(gòu)成的人類蛋白酶中,僅有約1/3 (141個)以單體形式存在,其余的蛋白酶均以聚合體形式存在,這其中有近一半(125個)為同源二聚體[10].聚集體的形成可以帶來很多好處.例如:聚集過程能夠使蛋白質(zhì)產(chǎn)生隨濃度變化而改變聚集狀態(tài)的調(diào)控機制,只有在達到一定酶濃度時,聚合體蛋白才能形成,從而實現(xiàn)特定的功能;多聚化能夠賦予蛋白酶新的結(jié)合界面,催化中心,別構(gòu)位點等;多聚蛋白酶具有比單體酶分子更強的目標(biāo)結(jié)合能力[10].蛋白質(zhì)這種聚集能力也可以節(jié)約生物體內(nèi)有限的基因資源.

現(xiàn)已報導(dǎo)的病毒蛋白酶中有相當(dāng)一部分是以二聚體形式存在的.而且研究發(fā)現(xiàn),這些病毒蛋白酶只有在二聚體中才有活性[11-12].這其中最著名的例子是人類免疫缺陷病毒HIV-1蛋白酶,其活性口袋位于二聚體界面上,活性中心由兩個亞基各提供一個Asp-25組成,所以只有二聚體形成之后才能有完整的活性中心[13].同樣以二聚來調(diào)控活性的還有人類肝炎病毒HCV蛋白酶,不同的是HCV蛋白酶的兩個亞基互相提供活性中心殘基,分別組成對稱的兩套催化中心[14].晶體結(jié)構(gòu)研究顯示冠狀病毒3CL蛋白酶二聚體中的兩個亞基分別擁有自己獨立的活性位點,且遠離其二聚體界面.我們的研究發(fā)現(xiàn),SARS 3CL蛋白酶同樣也需要形成二聚體才具有蛋白酶活性[15].SARS 3CL蛋白酶二聚體形成的原因,二聚體對于酶催化活性的調(diào)控作用等是非常有趣的問題.本研究小組在SARS爆發(fā)伊始,就運用理論計算與實驗結(jié)合的方法研究了SARS 3CL蛋白酶的生物化學(xué)性質(zhì)[16-18],酶催化反應(yīng)機理[15,19-20],并開展了基于結(jié)構(gòu)的抑制劑設(shè)計[21-22].

針對SARS 3CL蛋白酶二聚體的計算分析表明其二聚體的結(jié)合能力并不是很強[17],我們利用分析型超速離心方法,定量測出了純SARS 3CL蛋白酶二聚體的解離常數(shù)為14.0 μmol·L-1[18].以此推測,在常用的體外SARS 3CL蛋白酶測活條件下(酶的濃度一般為1-3 μmol·L-1),二聚體的含量很低,這似乎與必須形成二聚體才能有活性的觀點有所矛盾[15].為了解釋此現(xiàn)象,我們通過測定酶活性隨酶濃度的變化,推算出在底物存在下二聚體的表觀解離常數(shù)明顯變小,表明在測活條件下二聚體的含量有了顯著提高.

為了證實以上推測,我們選取了一個本實驗室在前期報導(dǎo)的與底物有類似結(jié)合的抑制劑分子N-萘甲基靛紅-5-甲酰胺(5f)[22],采用分析型超速離心實驗定量測定了在不同抑制劑濃度下二聚體含量的變化情況.分析型超速離心方法能夠在天然溶液條件下有效分析生物大分子的相對分子質(zhì)量分布情況[23-24].沉降速率實驗?zāi)軌蛑庇^靈敏地分析溶液中的大分子聚集狀態(tài)的分布,而沉降平衡實驗是目前最精確的測定大分子間同源或異源聚集體解離常數(shù)的手段之一[25-26].本文通過研究抑制劑5f對溶液中蛋白酶二聚體形成能力的影響,來分析說明分析型超速離心測得的純SARS 3CL蛋白酶的二聚體與由蛋白酶活性隨濃度變化研究擬合出的二聚體解離常數(shù)不一致的原因,探討可能的SARS 3CL蛋白酶二聚化相互別構(gòu)調(diào)控的機制.

1 材料與方法

1.1 蛋白酶的表達與純化

將含有SARS 3CL蛋白酶表達質(zhì)粒pET3CLpro-21h的大腸桿菌BL21〈DE3〉菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期,向培養(yǎng)液中加入終濃度1 mmol·L-1的IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside),在 30℃下誘導(dǎo)表達3 h后,離心收集菌泥.用20 mL裂解液(40 mmol·L-1NaH2PO4/Na2HPO4,pH 7.3,100 mmol·L-1NaCl,1 mmol·L-1EDTA(乙二胺四乙酸),3 mmol·L-1DTT(硫代蘇糖醇))重懸1 L培養(yǎng)液得到的菌泥,超聲裂解細胞.16000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心,收集上清液.向上清液中加入終濃度100 g·L-1的硫酸銨,充分?jǐn)嚢柚笠?6000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心,收集上清液.向上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至終濃度160 g·L-1,同樣充分?jǐn)嚢柚?再次以16000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心,收集沉淀.將沉淀溶于20 mL緩沖液A(20 mmol·L-1Tris-HCl,pH 8.5,1 mmol·L-1EDTA,1 mmol·L-1DTT),4℃下在1 L緩沖液A中透析充分.透析得到樣品經(jīng)陰離子交換色譜(HiTrap Q HP柱)分離純化,收集到的樣品經(jīng)過適當(dāng)濃縮后,通過凝膠過濾色譜(Sephacryl S-200 HR柱)再次純化,得到的蛋白酶樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳證實為95%以上的純度.得到的產(chǎn)品保存在緩沖液C(40 mmol·L-1NaH2PO4/ Na2HPO4,pH 7.3,100 mmol·L-1NaCl,1 mmol·L-1EDTA,3 mmol·L-1DTT)中,并加入50%(φ,體積分?jǐn)?shù))的甘油,-20℃保存?zhèn)溆?

1.2 蛋白酶的活性測定

本文所述所有蛋白酶活性測定實驗均使用本實驗室黃?？挡┦康冉⒌娘@色底物活性測定方法[18].所采用的底物為SARS 3CL蛋白酶自切位點P1-P6序列,將自切位點P′位Ser用顯色基團pNA代替(Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-pNA),酶催化水解Gln-pNA鍵,釋放出顯色化合物pNA,在390 nm波長下檢測.pNA在體系中的吸光系數(shù)為6.33 OD· mmol-1·L-1.測活反應(yīng)在37℃下進行.所使用的酶標(biāo)儀為SpectraMax GeminiXS(Molecular Device).底物由上海吉爾生化有限公司提供.

1.3 蛋白酶聚集狀態(tài)的測定

沉降速率實驗在Beckman Optima XLA分析型超速離心機上進行,使用An60Ti轉(zhuǎn)頭和雙孔樣品池進行實驗.新鮮純化的高純度樣品經(jīng)脫鹽柱或透析處理后,使樣品處于沉降緩沖液(40 mmol·L-1NaH2PO4/Na2HPO4,100 mmol·L-1NaCl,0.5 mmol·L-1EDTA,pH 7.3)中,其溶液環(huán)境與參照緩沖液完全一致.測得樣品在沉降實驗檢測波長230 nm下的吸收值,配置樣品濃度在該波長下吸收值的范圍為0.5-1.0.不含抑制劑的對照組為3 μmol·L-1的SARS 3CL蛋白酶,蛋白溶液及參照液中加入相應(yīng)量的不含抑制劑的純DMSO;含有抑制劑的樣品組,3 μmol·L-1的蛋白溶液與參照緩沖液中均加入濃度為3 mmol·L-1的抑制劑5f的DMSO(二甲基亞砜)儲液.雙孔樣品池中,分別加入380 μL蛋白酶樣品和400 μL參照緩沖液.樣品池在轉(zhuǎn)子中20℃,3000 r·min-1轉(zhuǎn)速下平衡1 h后,設(shè)定檢測波長為230 nm,在56000 r·min-1轉(zhuǎn)速下收集沉降速率數(shù)據(jù).實驗數(shù)據(jù)用軟件Sedfit v9.4(http://www.analyticalul-tracentrifugation.com/)分析處理.數(shù)據(jù)分析所需要的參數(shù), SARS 3CL蛋白酶在280 nm波長下的分子消光系數(shù)(1.04 mg·cm-2),沉降緩沖液的密度(1.005 g·mL-1), SARS 3CL蛋白酶的偏摩爾體積(0.723 mL·g-1),以及蛋白酶的分子量(33914 Da)均根據(jù)該蛋白酶的氨基酸組成通過軟 SENDNTERP(http://www.bbri.org/ rasmb/rasmb.html)計算得到.

2 結(jié)果與討論

2.1 底物增強的SARS 3CL蛋白酶二聚

為了研究底物對于SARS 3CL蛋白酶二聚化的影響,我們測定了在不同蛋白濃度下(0.14-1.65 μmol·L-1)酶的活性.如果二聚體酶是酶的活性狀態(tài),那么體系中蛋白酶二聚體的含量會隨著酶濃度的提高而增加.這意味著,單位酶的活性也會隨著酶濃度的提高而增加,而這一值在一般蛋白酶中是不變的.我們假設(shè)蛋白酶的總濃度為CE,在溶液中存在著單體M和二聚體酶M2的平衡,二聚體的解離常數(shù)為Kd,單體和二聚體的組分都有結(jié)合底物S的能力,則有:

假定在測活條件下酶與底物結(jié)合形成的復(fù)合物濃度可以忽略不計,

由此可以推出:

由酶活性實驗可以推出蛋白酶的表觀二級反應(yīng)速率常數(shù)(kcat/Km)app.相關(guān)的研究表明,SARS 3CL蛋白酶的活性主要是由二聚體所貢獻的[3,7-9,15-18],因此我們直接假設(shè)單體對于活性的貢獻為零,定義酶的表觀反應(yīng)速率為

由此推出:

將酶的表觀二級反應(yīng)速率常數(shù)(kcat/Km)app對蛋白酶濃度CE作圖(圖1),由公式(1)擬合得到結(jié)果為

二聚體活性(kcat/Km)dimer=(35.8±1.1)mmol-1·L· min-1.

二聚體解離常數(shù)Kd=(0.94±0.08)μmol·L-1.

2.2 抑制劑誘導(dǎo)二聚體形成

我們在上節(jié)中通過測定酶活性隨酶濃度變化的方法推算出在測活條件下二聚體的解離常數(shù)為0.94 μmol·L-1,與用分析型超速離心方法測定的純蛋白酶的解離常數(shù)(14.0 μmol·L-1)有明顯的差異[18].這可能是由于底物的存在提高了酶二聚體的結(jié)合能力.其它病毒蛋白酶(如HIV蛋白酶)中也存在著這種底物或抑制劑誘導(dǎo)二聚體形成的現(xiàn)象[27-28].為了更進一步研究SARS 3CL蛋白酶是否存在由底物或抑制劑誘導(dǎo)二聚的現(xiàn)象,我們選用了一個底物口袋結(jié)合抑制劑5f(圖2),利用沉降速率實驗研究了不同濃度的5f對于SARS 3CL蛋白酶聚集狀態(tài)的影響.該抑制劑對濃度為1 μmol·L-1的SARS 3CL蛋白酶的半抑制濃度IC50為0.37 μmol·L-1[22].

圖1 酶濃度依賴的活性曲線Fig.1 Concentration-dependent proteinase activity curve

圖2 抑制劑5f的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structure of the inhibitor 5f

為了模擬測活反應(yīng)的條件,使用較低濃度的蛋白酶(3 μmol·L-1),這一濃度條件下,蛋白酶幾乎完全以單體形式存在[18].針對三組樣品在同樣條件下進行沉降速率分析,對照組僅有3 μmol·L-1的SARS 3CL蛋白酶;第二組含有3 μmol·L-1的蛋白酶和1 μmol·L-1抑制劑;第三組含有3 μmol·L-1的蛋白酶與6 μmol·L-1抑制劑.

如圖3所示,對照組蛋白濃度為3 μmol·L-1的SARS 3CL蛋白酶在無抑制劑條件下沉降系數(shù)分布接近2.7 s,意味著溶液中的蛋白酶幾乎均以單體形式存在[18];3 μmol·L-1的SARS 3CL蛋白酶溶液中加入1 μmol·L-1的抑制劑5f(摩爾比3∶1)后,沉降系數(shù)分布曲線中,約有近一半的蛋白酶處于二聚體的狀態(tài)(4.1 s);僅加入2倍摩爾濃度的抑制劑5f(6 μmol· L-1)后,沉降系數(shù)分布曲線顯示溶液中的SARS 3CL蛋白酶基本上全部以二聚體形式存在(4.2 s).該實驗結(jié)果明確而直觀地證明,隨著抑制劑5f的濃度提高,SARS 3CL蛋白酶二聚體的形成能力增加,表明蛋白酶底物口袋結(jié)合小分子抑制劑后,改變了蛋白酶形成二聚體的能力.這與前面所得到的底物增強的酶二聚化現(xiàn)象一致.

進一步測定了3 μmol·L-13CL蛋白酶隨抑制劑5f濃度變化的聚集狀態(tài)分布情況,并由此估算出抑制劑5f對3 μmol·L-13CL蛋白酶誘導(dǎo)二聚的EC50值.測定了 5f濃度分別為 0、0.5、1、2、3、6 μmol·L-1時,3 μmol·L-13CL蛋白酶的聚集狀態(tài)情況.如圖4所示,在0.5-1 μmol·L-1的抑制劑濃度下,約半數(shù)蛋白酶處于二聚體形式,而蛋白酶與抑制劑在1∶1摩爾濃度下,90%以上的蛋白酶形成了二聚體,其對3 μmol·L-13CL蛋白酶的EC50值約為1 μmol·L-1.意味著只要溶液中約一半的蛋白酶分子與抑制劑分子結(jié)合后,幾乎全部的蛋白酶分子都能形成穩(wěn)定的二聚體.說明二聚體中的一個單體與抑制劑分子結(jié)合就可以提高二聚體的穩(wěn)定性,不需要兩個單體同時與抑制劑結(jié)合.我們的前期研究工作表明,SARS 3CL蛋白酶二聚體中只有一個單體是有活性的[17],但沒有活性的那個單體是否也與底物結(jié)合尚不清楚.由于5f與底物具有類似的結(jié)合方式,從本工作的研究結(jié)果可以推測SARS 3CL蛋白酶二聚體中只有活性單體才能與底物結(jié)合.SARS 3CL蛋白酶形成二聚體的原因被認為是一種調(diào)控酶活性的方式,只有在足夠高的酶濃度下才有活性可能是病毒為了等待有足夠多的蛋白質(zhì)表達出來再進行正確加工和組裝的一種策略.我們的研究表明,即使只有較低濃度的酶,隨著多聚蛋白底物濃度的升高,SARS 3CL蛋白酶會在底物的誘導(dǎo)下形成更多的二聚體,從而表現(xiàn)出更高的酶活性,這有可能是病毒用來調(diào)控多聚蛋白水解速度和組裝時機的一種方法.

圖3 沉降速率分析抑制劑5f誘導(dǎo)SARS 3CLpro的二聚體形成Fig.3 Sedimentation velocity analysis of the inhibitor 5f induced dimerization of SARS 3CL proteinase(A)the typical sedimentation velocity data of 3CLpro,(B)the residuals of fitting the upper panel A,(C)0 μmol·L-15f+3 μmol·L-13CLpro,(D)1 μmol·L-15f+3 μmol·L-13CLpro,(E)6 μmol·L-15f+3 μmol·L-13CLpro

圖4 抑制劑5f濃度依賴的SARS 3CLpro聚集狀態(tài)變化及EC50的測定Fig.4 Compound 5f concentration dependentsedimentation coefficient distribution and determination of EC50

3 結(jié) 論

利用酶活測定和分析型超速離心方法研究了SARS 3CL蛋白酶在底物和抑制劑存在下的二聚體形成情況.通過對蛋白酶活性隨濃度變化曲線,擬合出在底物存在下二聚體的解離常數(shù)為0.94 μmol·L-1.為了進一步研究這種底物誘導(dǎo)二聚的現(xiàn)象,選用小分子抑制劑5f作為模擬底物,利用沉降速率方法測定了不同抑制劑濃度對于蛋白酶聚集狀態(tài)的影響.研究結(jié)果表明SARS 3CL蛋白酶在溶液中二聚體的含量隨抑制劑濃度的升高而增多,表現(xiàn)出一種抑制劑誘導(dǎo)的蛋白酶二聚現(xiàn)象.進一步測定了該抑制劑誘導(dǎo)二聚體形成的EC50值,發(fā)現(xiàn)蛋白酶二聚體中可能只有一個單體與抑制劑分子結(jié)合.該研究結(jié)果有助于進一步揭示SARS 3CL蛋白酶活性的別構(gòu)調(diào)控機理,為新型抑制劑的設(shè)計提供新的思路.

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November 30,2009;Revised:March 15,2010;Published on Web:March 17,2010.

Substrate Binding and Homo-Dimerization of SARS 3CL Proteinase are Mutual Allosteric Effectors

WEI Ping1,2LI Chun-Mei1,2ZHOU Lu1LIU Ying1LAI Lu-Hua1,2,*
(1Beijing National Laboratory for Molecular Science,State Key Laboratory of Structural Chemistry of Unstable and Stable Species,College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University,Beijing 100871,P.R.China;2Center for Theoretical Biology,Peking University,Beijing 100871,P.R.China)

The 3C-like proteinase(3CLpro)of severe acute respiratory syndrome(SARS)coronavirus has been proposed to be a key target for anti-SARS drug discovery.It has been proposed and verified that the dimer was the active form of 3CLpro and only one protomer is active.In our previous work,we measured the dissociation constant(Kd)of the purified SARS 3CLpro using analytical ultracentrifugation at around 14.0 μmol·L-1.Using this Kdvalue,most of the SARS 3CLpro in the in vitro activity assay(1-3 μmol·L-1)might be in the monomer form and inactive.To explain this dilemma,we measured the enzyme activity change together with the enzyme concentration.By fitting the concentration dependent activity profile, the apparent dissociation constant was found to be 0.94 μmol·L-1,indicating a clear tendency toward substrate enhanced dimerization.This also explains why SARS 3CLpro was still active in the in vitro activity assay under a relatively low enzyme concentration.To further verify the substrate induced dimerization phenomenon,we selected a previously reported SARS 3CLpro isatin inhibitor,1-(2-naphthlmethyl)isatin-5-carboxamide(5f),which has similar binding interactions with the substrate and we studied its influence on SARS 3CLpro dimer formation using analytical ultracentrifugation.5f showed a strong ability to induce SARS 3CLpro dimer formation.By measuring the dimer and monomer distribution under different 5f concentrations,the EC50of dimerinduction was found to be about 1.0 μmol·L-1under an enzyme concentration of 3.0 μmol· L-1.This implies that only one protomer in the SARS 3CLpro dimer binds to the inhibitor or the substrate.As the apparent association constant and thus the enzyme activity of SARS 3CLpro increases with the concentration of the substrate,this may be a smart way to allosterically regulate the hydrolysis of the SARS viral polyproteins and the correct assembly of virons.

Allosteric effect;SARS;3CL proteinase;Analytical ultracentrifugation;Substrate enhanced enzyme dimerization

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*Corresponding author.Email:lhlai@pku.edu.cn;Tel:+86-10-62757486.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(10721403,20473001)and the Ministry of Science and Technology of China.

國家自然科學(xué)基金(10721403,20473001)和國家科技部資助項目