原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證藥效評(píng)價(jià)模型的建立

盧阿娜，蔡妍陽(yáng)，宋 夢(mèng)，張文通，趙 欣，徐雪雁，蔡大勇

原發(fā)性痛經(jīng)無特異性藥物治療的主要原因是缺乏藥效評(píng)價(jià)模型［1］。中醫(yī)臨床對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)進(jìn)行辨證施治，其中，對(duì)最常見的寒凝血瘀證，重視寒性癥狀群和疼痛癥狀群［2］。寒性癥狀群的臨床病理生理機(jī)制為適應(yīng)性產(chǎn)熱低下［3］，異丙腎上腺素所誘導(dǎo)的產(chǎn)熱潛能可定量觀察該產(chǎn)熱低下［4］。疼痛癥狀群的臨床病理生理機(jī)制為局部宮腔痙攣性收縮［5］，催產(chǎn)素所誘導(dǎo)的宮腔內(nèi)壓可定量觀察該局部攣縮［6］。因此，序貫實(shí)施肩胛骨間棕色脂肪切除、抑制甲狀腺功能和促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生建立原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證的大鼠模型;以模型大鼠為研究對(duì)象，分析靜脈給予異丙腎上腺素誘導(dǎo)產(chǎn)熱和催產(chǎn)素誘導(dǎo)宮腔內(nèi)壓的量效關(guān)系。結(jié)果所計(jì)算獲得的ED50可作為原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證藥效評(píng)價(jià)的合適刺激劑量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 ♀ SD大鼠36只，6周齡，體質(zhì)量(190.1±12.5)g購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;標(biāo)準(zhǔn)飼料購(gòu)自北京科澳飼料有限公司。每日光照黑暗各12 h，溫度25℃，濕度45%，自由飲食。

1.1.2 試劑 上海禾豐制藥有限公司的鹽酸異丙腎上腺素注射液(1 mg/2 ml，生產(chǎn)批號(hào)080401)和催產(chǎn)素注射液(10 U·ml－1，生產(chǎn)批號(hào)081102)，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司丙硫氧嘧啶片(50 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)090301)，北京益民藥業(yè)有限公司己烯雌酚片(1 mg/片)。

1.1.3 設(shè)備 高壓滅菌鍋;烤箱;空調(diào);溫度計(jì);自制拉鉤器材;BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng);溫度傳感器與壓力傳感器各4只;自制子宮頸擴(kuò)張器系列、壓力傳導(dǎo)導(dǎo)管及其末端橡膠球囊。

1.2 動(dòng)物分組處理

1.2.1 模型建立 36只大鼠均進(jìn)行下述造模處理。

1.2.1.1 棕色脂肪切除 動(dòng)物適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后，均進(jìn)行肩胛骨間棕色脂肪切除。腹腔注射10%水合氯醛0.003 ml·g－1麻醉，俯臥位固定，備毛，消毒，鋪孔巾。無菌操作，兩肩胛骨上下緣連線中點(diǎn)作為背正中線切口的起止點(diǎn)(約2.0 cm)，沿皮下組織分離皮膚，拉鉤暴露肩胛骨間蝶形棕色脂肪，沿邊緣外2 mm，肌層以上，完整切除蝶形棕色脂肪;帶著皮下筋膜縫合手術(shù)切口。碘伏棉球包扎，手術(shù)前后各3 d肌肉注射青霉素0.02萬U·g－1預(yù)防感染。

1.2.1.2 甲狀腺機(jī)能抑制 術(shù)后d 7開始，灌胃給予含丙硫氧嘧啶(30 μg·g－1)的 0.5%CMC 混懸液 5 μl·g－1，連續(xù)42 d。

1.2.1.3 子宮內(nèi)膜增生 術(shù)后d 21開始，灌胃給予含雌激素(1 μg·g－1)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%CMC 混懸液5 μl·g－1，連續(xù)28 d。

1.2.1.4 宮頸預(yù)擴(kuò)張 術(shù)后d 40開始，采用系列宮頸擴(kuò)張器(直徑依次為 1，2，3，4，5，6 mm)逐日增大擴(kuò)張器直徑，在自制拉鉤引導(dǎo)下，以眼科鏡光源直視宮頸口，擴(kuò)張宮頸，每天2次(8 am和8 pm)，直徑6 mm，鞏固2 d。溫度傳感器探頭直徑為2.5 mm，自制壓力插管前端球囊零壓力下直徑為4 mm，均小于最大擴(kuò)張器直徑6 mm。

1.2.2 分組處理 所造模的36只大鼠(190.1±12.5 g)，禁食12 h后稱質(zhì)量。體質(zhì)量均衡，隨機(jī)分9組，每組4只。術(shù)后d 47進(jìn)行9個(gè)等比劑量組的異丙腎上腺素刺激產(chǎn)熱觀察;術(shù)后d 49進(jìn)行9個(gè)等比劑量組的催產(chǎn)素誘導(dǎo)宮腔內(nèi)壓觀察。

1.2.3 指標(biāo)觀察 檢測(cè)環(huán)境溫度28℃，濕度45%，減低噪音、光照、震動(dòng)和空氣對(duì)流(風(fēng)速)。生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)接零線屏蔽干擾，預(yù)先調(diào)零及定標(biāo)。

1.2.3.1 異丙腎上腺素誘導(dǎo)產(chǎn)熱 乙醚淺時(shí)程麻醉后仰臥固定，子宮腔內(nèi)距宮頸20～24 mm放置溫度傳感器探頭;用注射器連接頭皮針，吸取所計(jì)算稀釋的鹽酸異丙腎上腺素濃度，排凈氣泡，用頭皮針進(jìn)行尾靜脈穿刺并固定;連續(xù)監(jiān)測(cè)清醒大鼠宮腔內(nèi)局部溫度變化，當(dāng)溫度曲線穩(wěn)定30 min后，尾靜脈注射給予相應(yīng)劑量的異丙腎上腺素，記錄120 min溫度。以給藥前后單位時(shí)間曲線下面積的變化率計(jì)算誘導(dǎo)產(chǎn)熱的ED50。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出異丙腎上腺素刺激正常大鼠產(chǎn)熱劑量有效范圍［7］，以 0.1 μg·g－1為中心，k=0.8，設(shè)計(jì) 9個(gè)劑量組，即 0.064、0.08、0.1、0.125、0.156、0.195、0.244、0.305、0.382 μg·g－1。

1.2.3.2 催產(chǎn)素誘導(dǎo)子宮腔內(nèi)高壓 水合氯醛麻醉后仰臥固定，子宮腔內(nèi)距宮頸20～24 mm放置壓力傳感導(dǎo)管的末端橡膠球囊(4 mm未充盈直徑);連接壓力傳感器通道，并排凈傳感通道的所有氣泡，微量螺旋注射器通過三通管施加前負(fù)荷，按預(yù)實(shí)驗(yàn)得大鼠子宮腔內(nèi)壓力最適前負(fù)荷［8］，用注射器連接頭皮針，吸取所計(jì)算稀釋的催產(chǎn)素濃度，排凈氣泡，用頭皮針進(jìn)行尾靜脈穿刺并固定;連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠宮腔內(nèi)局部壓力變化，當(dāng)壓力曲線穩(wěn)定30 min后，撤銷前負(fù)荷，使子宮無壓力自由收縮舒張5 min后，再給予相同前負(fù)荷，尾靜脈注射給予相應(yīng)劑量的催產(chǎn)素，記錄30 min壓力。以給藥前后曲線下面積的變化率計(jì)算誘導(dǎo)宮縮的ED50。根據(jù)小鼠預(yù)實(shí)驗(yàn)所得催產(chǎn)素ED500.04 U·g－1的大鼠等效劑量0.02 U·g－1為中心，k=0.75，設(shè)計(jì) 9 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即 0.006、0.008、0.011、0.015、0.020、0.027、0.036、0.047、0.063 U·g－1。

1.3 數(shù)據(jù)分析 以產(chǎn)熱溫度曲線下面積，計(jì)算異丙腎上腺素給藥所致面積變化率［δST=(STa-STb)/STb］;以宮腔內(nèi)壓力曲線下面積，計(jì)算催產(chǎn)素給藥所致面積變化率［δSP=(SPa-SPb)/SPb］;以±s表示各劑量組變化率數(shù)據(jù)，以給藥對(duì)數(shù)劑量對(duì)面積變化率，用Prism-4統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算異丙腎上腺素或催產(chǎn)素用量的ED50及其95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 異丙腎上腺素誘導(dǎo)原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證大鼠適應(yīng)性產(chǎn)熱的量效關(guān)系 數(shù)據(jù)(Tab 1)結(jié)果表明，異丙腎上腺素誘導(dǎo)痛經(jīng)寒凝血瘀證模型大鼠產(chǎn)熱的ED50為0.210 μg·g－1，95%置信區(qū)間為0.167～0.264 μg·g－1，用量與單位時(shí)間曲線下面積變化率相關(guān)方程為 ^Y=0.01503+0.03611/(1+106.839(0.03891－x))，r=0.969。

2.2 催產(chǎn)素誘導(dǎo)原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證大鼠子宮腔內(nèi)壓的量效關(guān)系 數(shù)據(jù)(Tab 2)結(jié)果表明，催產(chǎn)素誘發(fā)寒凝血瘀證大鼠宮腔壓力的 ED50為0.028 U·g－1，95%置信區(qū)間為0.012～0.066 U·g－1，用量與曲線下面積變化率相關(guān)方程為 ^Y=0.04479+0.55421/(1+101.626(0.1427－x))，r=0.967。

3 討論

臨床流行病學(xué)調(diào)查原發(fā)性痛經(jīng)，發(fā)現(xiàn)我國(guó)寒凝血瘀型痛經(jīng)的比例高、危害大，迄今沒有特異性西藥，針對(duì)其“寒冷”和“疼痛”兩大癥狀群［2］，實(shí)驗(yàn)分析靜脈給予異丙腎上腺素誘導(dǎo)產(chǎn)熱和催產(chǎn)素誘導(dǎo)宮腔內(nèi)壓的量效關(guān)系，為原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證藥效評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)中異丙腎上腺素誘導(dǎo)產(chǎn)熱采用乙醚麻醉，大鼠清醒狀態(tài)下準(zhǔn)確反映機(jī)體產(chǎn)熱狀態(tài);催產(chǎn)素誘導(dǎo)宮縮采用水合氯醛麻醉，由于乙醚有輕微舒張平滑肌的作用，且淺麻醉下大鼠掙扎劇烈，壓力曲線出現(xiàn)雜峰干擾，因此，壓力和溫度分別檢測(cè)。由于預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)壓力檢測(cè)時(shí)子宮出現(xiàn)適應(yīng)性舒張，因此采取催產(chǎn)素注射前后各觀察記錄30 min壓力曲線，且用藥前恢復(fù)子宮功能狀態(tài)5 min，可減少此因素的影響作用。檢測(cè)方法穩(wěn)定后，對(duì)異丙腎上腺素或催產(chǎn)素的對(duì)數(shù)劑量與曲線下面積變化率用Prism-4統(tǒng)計(jì)軟件分析，獲得半效劑量。

Tab 1 Thermogenesis induced by ISO in rats with primary dysmenorrhea±s，n=4)

Tab 1 Thermogenesis induced by ISO in rats with primary dysmenorrhea±s，n=4)

lg［ISO］δS 1.81 0.0150 ±0.0006 1.90 0.0107 ±0.0004 2.00 0.0227 ±0.0009 2.10 0.0101 ±0.0004 2.19 0.0173 ±0.0007 2.29 0.0318 ±0.0012 2.39 0.0372 ±0.0014 2.48 0.0475 ±0.0018 2.58 0.0515 ±0.0020

Tab 2 Uterine pressure induced by OXT in rats with primary dysmenorrhea(±s，n=4)

lg［OXT］δS 0.80 0.0580 ±0.0027 0.93 0.0488 ±0.0023 1.05 0.1820 ±0.0086 1.18 0.1021 ±0.0048 1.30 0.2035 ±0.0096 1.43 0.3069 ±0.0145 1.55 0.4465 ±0.0211 1.68 0.4038 ±0.0191 1.80 0.5490 ±0.0259

Fig 1 Thermogenesis induced by ISO in rats with primary dysmenorrhea(±s，n=4)

Fig 2 Uterine pressure induced by OXT in rats with primary dysmenorrhea(±s，n=4)

成人與嚙齒類動(dòng)物熱穩(wěn)態(tài)的最大區(qū)別是棕色脂肪消退，由其它細(xì)胞替代產(chǎn)熱，即整體總產(chǎn)熱功能從兒童期棕色脂肪向成人期非棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)移。手術(shù)切除肩胛骨間棕色脂肪并給予甲狀腺機(jī)能抑制藥物的大鼠，將導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱機(jī)能下降，出現(xiàn)全身及局部的產(chǎn)熱不足;乙烯雌酚可促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，增強(qiáng)子宮肌層收縮，提高子宮對(duì)催產(chǎn)素的敏感性。催產(chǎn)素對(duì)子宮平滑肌有選擇性興奮作用，可使子宮收縮增強(qiáng);子宮內(nèi)膜體積增加和收縮加強(qiáng)，出現(xiàn)子宮張力增大，痙攣收縮導(dǎo)致劇烈疼痛。本實(shí)驗(yàn)中雌激素己烯雌酚用量采用文獻(xiàn)報(bào)道［9］小鼠用量 2 μg·g－1轉(zhuǎn)化為大鼠 1 μg·g－1造成子宮內(nèi)膜增生;異丙腎上腺素誘導(dǎo)模型大鼠適應(yīng)性產(chǎn)熱最適劑量較文獻(xiàn)報(bào)道劑量［7］升高，提示了模型的寒癥特征;催產(chǎn)素誘導(dǎo)子宮痙攣性收縮的最適劑量較文獻(xiàn)報(bào)道劑量［10］轉(zhuǎn)化大鼠劑量略有升高，可能與本模型的寒癥有關(guān)，或者是催產(chǎn)素的生物學(xué)效能存在差異。研究異丙腎上腺素誘導(dǎo)適應(yīng)性產(chǎn)熱和催產(chǎn)素誘導(dǎo)子宮痙攣的最適劑量，可作為原發(fā)性痛經(jīng)兩大癥狀療效評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確指標(biāo)。

本研究建立了肩胛骨間棕色脂肪、切除聯(lián)合丙硫氧嘧啶抑制產(chǎn)熱和雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生的原發(fā)性痛經(jīng)寒凝血瘀證的大鼠模型;在造模大鼠上，確定了異丙腎上腺素誘導(dǎo)適應(yīng)性產(chǎn)熱和催產(chǎn)素誘導(dǎo)子宮痙攣的最適劑量，可作為評(píng)價(jià)原發(fā)性痛經(jīng)痙攣性疼痛程度及其受局部溫度影響的準(zhǔn)確指標(biāo)，探索了定量研究方法的具體實(shí)施條件，有益于提高中西醫(yī)結(jié)合診治療疾病的準(zhǔn)確性，為婦科藥理學(xué)或證候藥理學(xué)積累了實(shí)驗(yàn)資料。

［1］嵇 波，張露芬，朱 江，等.痛經(jīng)模型建立和評(píng)價(jià)方法的思考［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(6):711 －4.

［1］Ji B，Zhang L F，Zhu J，et al.On building the dysmenorrhea model and a ssessment methods［J］.China Pharmacol Bull，2008，24(6):711－4.

［2］黨海珍，滕久祥，彭芝配，等.原發(fā)性痛經(jīng)疼痛的中西醫(yī)研究概況［J］.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，20(3):70 －3.

［2］Dang H Z，Teng J X，Peng Z P，et al.Research summary about the mechanism of primary dysmenorrheal in both traditional Chinese and western medicine［J］.J Hunan Univ TCM，2000，20(3):70 －3.

［3］Akin M，Price W，Rodriguez G，et al.Continuous，low-level，topical heat wrap therapy as compared to acetaminophen for primary dysmenorrhea［J］.J Reprod Med，2004，49(9):739 －7.

［4］Cannon B，Nedergaard J.Brown adipose tissue:function and physiological significance［J］.Physio Rev，2004，84(1):277 －358.

［5］Proctor M，F(xiàn)arquhar C.Diagnosis and management of dysmenorrhoea［J］.BMJ，2006，332:1134 － 5.

［6］Meddle S L，Bishop V R，Gkoumass E，et al.Dynamic changes in oxytocin receptor expression and activation at parturition in the rat brain［J］.Endocrinology，2007，148(10):5095 －10.

［7］王 勇，李國(guó)彰，唐炳華，等.異丙腎上腺素對(duì)雌性大鼠的產(chǎn)熱效應(yīng)［J］.中國(guó)藥師，2007，10(8):758 －60.

［7］Wang Y，Li G Z，Tang B H，et al.Thermogenesis induced with isoprenaline in female rats［J］.China Pharmacist，2007，10(8):758－60.

［8］盧阿娜，張文通，宋 夢(mèng).大鼠子宮腔內(nèi)壓測(cè)定的最適前負(fù)荷［J］.中國(guó)藥師，2009，12(12):1683 －5.

［8］Lu A N，Zhang W T，Song M.Suitable preload for intrauterine optimum pressure in rats［J］.China Pharmacist，2009，12(12):1683－5.

［9］孫海燕，曹永孝，劉 靜，等.小鼠痛經(jīng)模型的建立［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18(2):233 －6.

［9］Sun H Y，Cao Y X，Liu J，et al.The establishment of the dysmenorrhea model in mice［J］.China Pharmacol Bull，2002，18(2):233－6.

［10］Ichikawa S，Tamada H.The effect of oestrogen on uterine plasticity in late pregnant rats［J］.J Reprod Fertil，1980，58(1):165 －8.