氯沙坦抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有凋亡途徑在糖尿病大鼠腎臟中的保護(hù)作用

曹延萍，王 建，李 航，劉青娟，段惠軍

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)通過血流及非血流動(dòng)力學(xué)因素，在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，氯沙坦為血管緊張素Ⅱ受體1拮抗劑(angiotensinⅡreceptor 1 antagonosm，AT1RA)，通過阻斷 AngⅡ與其受體結(jié)合，具有腎臟保護(hù)作用，研究表明［1］氯沙坦可以通過影響凋亡相關(guān)基因bax和bcl-2表達(dá)而抑制腎臟細(xì)胞凋亡。本研究觀察了氯沙坦對(duì)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞增殖、凋亡以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)標(biāo)志蛋白 GRP78及其特有的凋亡途徑Caspase-12表達(dá)的影響，探討這種保護(hù)作用是否部分通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特有凋亡途徑實(shí)現(xiàn)，以期對(duì)其保護(hù)腎臟機(jī)制得以更深一步的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar♂大鼠由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司)，小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)，兔抗GRP78單克隆抗體(NeoMarkers公司)，Caspase-12單克隆抗體(Abcam生物制品有限公司)，TUNEL試劑盒(Promega公司)，科素亞(杭州默沙東制藥有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型及分組 選取體質(zhì)量120～140 g♂Wistar大鼠30只，所有大鼠均用戊巴比妥鈉(40 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，行右腎切除術(shù)。2周后大鼠切口完全愈合。隨機(jī)分為右腎切除對(duì)照組(A組n=10)、糖尿病組(B組n=10)和氯沙坦治療組(C組n=10)。B組和C組大鼠腹腔單次注射STZ(65 mg·kg－1WT，用 pH 4.5，0.1 mol·L－1枸櫞酸鈉緩沖液配制)，A組只注射相同體積的枸櫞酸鈉緩沖液。48～72 h后，血糖≥16.7 mmol·L－1，尿糖～確認(rèn)為糖尿病模型。C組每天用氯沙坦按40 mg·kg－1灌胃56 d，A及B組只灌等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)飲食，不使用胰島素及其他降糖藥物。

1.2.2 標(biāo)本收集 DM模型建成后，每周測血糖1次，不符合標(biāo)準(zhǔn)者棄去;于成模8周稱重后用代謝籠收集24 h尿，乙醚麻醉，股動(dòng)脈取血，分離血清，用于生化指標(biāo)測定。切取左腎，去掉被膜，濾紙吸干血跡后稱重，部分置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.04多聚甲醛固定留做HE、PAS染色及免疫組化、TUNEL檢測，部分置于體積分?jǐn)?shù)為70的乙醇固定后行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.2.3 血、尿生化指標(biāo)測定 Glu、Scr、Ucr、BUN、尿蛋白均用日立7170A全自動(dòng)生化分析儀測定，并計(jì)算肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)。

1.2.4 常規(guī)病理學(xué)觀察 腎組織石蠟包埋后切片2 μm，常規(guī)HE、PAS染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測 采用SP法。2 μm腎組織切片，常規(guī)脫蠟至水，一抗PCNA、GRP78(1∶100)，Caspase-12(1∶1000)稀釋，二抗為生物素化山羊抗兔IgG，PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯微鏡控制下顯色。

1.2.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 腎臟2 μm切片常規(guī)脫蠟入水，蛋白酶K室溫下消化，TDT酶反應(yīng)液37℃孵育1 h，體積分?jǐn)?shù)為0.3 H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶，Streptavidin-HRP室溫5 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陰性對(duì)照采用無酶標(biāo)記液(刪除TDT)代替TDT酶反應(yīng)液。凋亡細(xì)胞核呈棕褐色顆粒，光鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平及GRP78和Caspase-12的表達(dá) 將標(biāo)本用網(wǎng)搓法制成單細(xì)胞懸液，采用間接免疫熒光法，在細(xì)胞懸液中分別加入1∶200稀釋的兔抗 GRP78和1∶1000的兔抗Caspase-12單克隆抗體，37℃溫浴30 min后洗滌，加入羊抗兔FITC-IgG，溫浴洗滌后行流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司，Epics-XLⅡ型)檢測，測量的數(shù)據(jù)應(yīng)用相應(yīng)的程序進(jìn)行資料處理，測定前以標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。GRP78和Cas pase-12表達(dá)的定量分析以熒光指數(shù)(FI)表示其相對(duì)含量:FI=(樣品的平均熒光強(qiáng)度－對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度)/正常組織平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 腎功能改變 8 wk時(shí)B組與A組相比，血糖、BUN和尿蛋白明顯增高，Ccr明顯降低(P＜0.05)，C組與B組相比，血糖、BUN和尿蛋白降低，Ccr升高(P ＜0.05)，見 Tab 1。

2.2 腎組織病理學(xué)檢查 光鏡下A組腎組織未見病理改變，B組大鼠腎小球細(xì)胞外基質(zhì)略增生，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，可見空泡變性，部分萎縮或擴(kuò)張。C組與B組相比病變明顯減輕。

Tab 1 Serum glucose，BUN，Ccr and 24 h urinary protein excretion in group A，B and C(n=10)

2.3 免疫組織化學(xué)檢測 PCNA、GRP78及Caspase-12在腎臟定位表達(dá):PCNA、GRP78、Caspase-12在正常對(duì)照組大鼠腎皮質(zhì)均有表達(dá)，PCNA陽性細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色，在100倍視野中連續(xù)不重疊的計(jì)數(shù)100個(gè)腎小管的細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)及50個(gè)腎小球的陽性細(xì)胞數(shù)，以腎小管細(xì)胞的陽性率和單個(gè)腎小球切面的陽性細(xì)胞數(shù)作為比較指標(biāo)。3組腎皮質(zhì)小球、小管內(nèi)均可見陽性細(xì)胞，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GRP78在A組弱表達(dá)，主要位于遠(yuǎn)端小管和集合管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi);B組表達(dá)明顯增多增強(qiáng)，尤以近曲小管胞質(zhì)最為明顯，部分腎小球內(nèi)細(xì)胞胞質(zhì)也呈強(qiáng)陽性表達(dá)。Caspase-12 A組有表達(dá)，主要位于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，B組表達(dá)明顯增強(qiáng)，小管及小球內(nèi)均可見陽性表達(dá)。C組GRP78、Caspase-12表達(dá)部位與B組大致相同，程度介于A組、B 組之間(見 Fig 1、2)。

Fig 1 Immunohistochemical staining of GRP78 protein in renal cortex at 8 week (×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

Fig 2 Immunohistochemical staining of Caspase-12 protein in renal cortex at 8 week (×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡程度及對(duì)GRP78和Caspase-12半定量分析結(jié)果 B組細(xì)胞凋亡率、GRP78及Caspase-12表達(dá)程度較A組明顯增高，C組細(xì)胞凋亡率、GRP78及Caspase-12表達(dá)較A組有所增高，但較B組明顯降低，見Tab 2。

Tab 2 The expression of GRP78，Caspase-12 protein and apoptosis by flow cytometry

2.5 TUNEL定位檢測腎臟凋亡細(xì)胞 A組腎小管偶見凋亡細(xì)胞，B組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增高，小球、小管內(nèi)均有陽性表達(dá)，但主要位于小管上皮細(xì)胞，尤以皮髓質(zhì)交界處多見，C組凋亡細(xì)胞較B組有所減少(Fig 3)。

Fig 3 The apoptotic cells in renal cortex at 8 week (TUNEL staining×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

3 討論

腎素－血管緊張素系統(tǒng)(RAS)對(duì)血壓調(diào)節(jié)和水、電解質(zhì)平衡起重要作用，血管緊張素肽Ⅱ(AngⅡ)是RAS的活性成分，在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。除經(jīng)典的調(diào)節(jié)血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)外，AngⅡ可導(dǎo)致ECM聚積和TGF-β表達(dá)明顯增加，刺激氧自由基及細(xì)胞因子的釋放，抑制一氧化氮(NO)合成［2］，除此之外還可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。AT1RA氯沙坦可以阻斷Ang II與其受體結(jié)合，具有良好的腎臟保護(hù)作用［3－5］，本實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠8 wk時(shí)，腎功能下降，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，腎小球和腎小管PCNA陽性細(xì)胞數(shù)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示8 wk DM組大鼠腎臟細(xì)胞過度凋亡，氯沙坦治療組大鼠腎功能較糖尿病組明顯好轉(zhuǎn)，凋亡細(xì)胞數(shù)大大降低，證實(shí)了它的腎臟保護(hù)作用，并且這種作用部分通過抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。

ERS是近年發(fā)現(xiàn)的一條新的內(nèi)在凋亡途徑，在糖尿病臟器損害過程中普遍存在。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)對(duì)內(nèi)環(huán)境的改變高度敏感，缺血缺氧、錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚、炎癥因子等都可干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能，這種亞細(xì)胞器病理狀態(tài)稱為ERS。適度的ERS可以恢復(fù)ER及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保持細(xì)胞活性，但過強(qiáng)或過長時(shí)間的ERS將最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。AngⅡ本身及其后續(xù)多種生物學(xué)效應(yīng)均可作為應(yīng)激源誘導(dǎo)ERS，檢測ERS標(biāo)志蛋白GRP78及特有凋亡途徑Caspase-12的表達(dá)，分析DM大鼠腎組織局部ERS狀態(tài)，旨在更深入的探討AT1RA氯沙坦的腎臟保護(hù)作用的潛在機(jī)制。

78 000 u-糖調(diào)節(jié)蛋白(78 000 u glucose-regulated protein GRP78)屬于熱休克蛋白(HSP70)家族，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件PKR、IRE1以及ATF6的結(jié)合抑制ERS的激活，在未折疊蛋白反應(yīng)中發(fā)揮主要調(diào)控作用，GRP78的誘導(dǎo)廣泛被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志性分子［6］。結(jié)果顯示，糖尿病組GRP78表達(dá)高于對(duì)照組，主要位于腎皮質(zhì)近曲小管，部分腎小球也有表達(dá)。而氯沙坦治療組GRP78表達(dá)明顯下調(diào)，提示氯沙坦治療減弱了糖尿病大鼠腎組織局部ERS狀態(tài)。

Caspase-12定位于ER外膜，屬于Caspase亞家族成員，ERS時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增高，引起胞質(zhì)內(nèi)鈣蛋白酶(calpain)活化并轉(zhuǎn)位ER膜，激活Caspase-12，活化的Caspase-12在無需細(xì)胞色素C參與的情況下可以進(jìn)一步激活Caspase-9和Caspase-3引起凋亡，是獨(dú)立于膜受體或線粒體凋亡途徑的ERS特有凋亡途徑［7］。轉(zhuǎn)染了抗Caspase-12抗體的豬腎小管上皮細(xì)胞系LLC-PK細(xì)胞可以有效的抵抗順鉑誘導(dǎo)的凋亡［8］，是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵蛋白酶。DM組大鼠腎組織中Caspase-12表達(dá)較正常對(duì)照組明顯上調(diào)，氯沙坦治療組Caspase-12表達(dá)盡管沒有恢復(fù)到正常水平，但較DM組表達(dá)下降，并伴有腎組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示氯沙坦的腎臟保護(hù)作用可能是部分是通過抑制過強(qiáng)的 ERS，進(jìn)一步抑制Caspase-12的活化，減少細(xì)胞凋亡而發(fā)揮的。盡管這種作用機(jī)制尚未完全清楚，推測可能與下列因素有關(guān):①AT1RA阻斷AngⅡ與其受體結(jié)合，改善腎血流狀態(tài)，緩解腎小球內(nèi)高壓及缺氧，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，有效逆轉(zhuǎn)ERS，從而減少凋亡發(fā)生。②AngⅡ可與胞膜受體結(jié)合，使受體依賴鈣離子通道開放，致細(xì)胞內(nèi)鈣離子聚積［9］，可以刺激氧自由基及細(xì)胞因子的釋放［10］等，都可以作為應(yīng)激源誘發(fā) ERS，AT1RA 抑制其與受體結(jié)合，從根本上減少應(yīng)激源的產(chǎn)生，減弱了ERS強(qiáng)度，抑制了ERS特有凋亡途徑，從而發(fā)揮了腎臟保護(hù)作用。

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