PTEN抑制劑對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的保護(hù)作用

葛東建，劉功儉

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由多種炎性介質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與，并呈級聯(lián)放大的瀑布樣炎癥繼發(fā)性損傷與繼發(fā)性彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷［1］，是臨床常見的呼吸系統(tǒng)急危重癥。由于ALI/ARDS病因與發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，近年來盡管進(jìn)行了大量的研究，但其病死率仍居高不下。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞生長、存活、分化的信號通路。有研究證實(shí)［3］激活該信號通路，能保護(hù)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的肺上皮細(xì)胞［2］和抑制肺上皮細(xì)胞凋亡。但PI3K/Akt在內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的ALI中的作用還不十分清楚。PTEN蛋白(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten)是PI3K/Akt通路主要的負(fù)性調(diào)節(jié)器，通過磷脂酶活性使PIP3脫磷酸，抑制PI3K/Akt信號通路［4］。phen是PTEN的特異性抑制劑，目前已被廣泛的應(yīng)用于科學(xué)研究。本文通過研究phen對ALI中Akt活化的影響來探討其在LPS誘導(dǎo)ALI中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年♂ SD大鼠，體質(zhì)量230～250 g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 試劑 LPS(E coli，055:B5)購自 Sigma(St Louis，MO)。Bpv(phen)購自 Alexis?？?Akt抗體(sc-9272)、抗p-Akt(sc-9271)抗體均購自 Cell Signaling。TNF-α和IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒購自武漢博士德。

1.3 模型制備和分組 取32只大鼠，隨機(jī)分為兩組:LPS組和phen+LPS組(n=16)，比較了兩組大鼠48 h的累計(jì)死亡率。

另取60只大鼠被隨機(jī)分為4組:對照組(control組，n=6)，僅注射等體積的生理鹽水;LPS組(n=24)，經(jīng)尾靜脈注射LPS 5mg·kg-1;phen+LPS組(n=24)，在注射 LPS前1 h腹腔注射 phen 1.6 μmol·kg-1;phen 組(n=6)，腹腔注射 phen 1.6 μmol·kg-1，1 h后經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水。本實(shí)驗(yàn)中所選擇的藥物劑量以及給藥方式是參照文獻(xiàn)［5］以及我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)動物在各時(shí)間點(diǎn)，麻醉狀態(tài)下經(jīng)腹主動脈放血處死。開胸暴露兩肺。取出右肺中葉，迅速凍存于液氮中以備勻漿。取右肺下葉，浸泡于10%中性甲醛溶液中固定，然后用石蠟包埋制成蠟塊，5 μm厚連續(xù)石蠟切片，HE染色，在光鏡下觀察肺組織的病理學(xué)變化。取右肺上葉，稱濕重，然后置于80℃烘箱中烘烤直至恒重再稱重，計(jì)算肺濕干重比(W/D)。結(jié)扎右肺門，用5ml預(yù)冷的PBS分3次灌洗左肺?；厥章蔬_(dá)到90%?；厥盏闹夤芊闻莨嘞匆?bronchoalveolarlavage fluid，BALF)儲存在 -80℃以備檢測蛋白和細(xì)胞因子濃度。BALF中的蛋白濃度測定采用BCA法(Bicinchoninic acid)。TNF-α和IL-6的濃度測定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot)參照文獻(xiàn)［6］，提取組織的胞質(zhì)蛋白。用BCA法測定蛋白濃度，然后保存于-80℃待用。

蛋白樣本加入4倍的上樣緩沖液，煮沸5 min。等量蛋白樣品經(jīng)12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜經(jīng)3%牛血清白蛋白室溫封閉2 h后，分別加入下列一抗4℃過夜:抗Akt抗體(1∶1 000)、抗p-Akt抗體(1∶500)。用Tris緩沖液吐溫-20(TBST)洗膜3遍，然后用相應(yīng)的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，最后用NBT/BCIP(Promega，上海)顯色。掃描結(jié)果用圖像分析儀(LabWorks Software，UVP Upland，CA，USA)處理，數(shù)據(jù)進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 phen對LPS導(dǎo)致的死亡率的影響 LPS組，大鼠48 h死亡率高達(dá)56.3%(共死亡9只)。而phen+LPS組，大鼠48 h死亡率僅有18.8%(共死亡3只)，明顯低于LPS組(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 phen，PTEN inhibitor，suppresses LPS-induced mortality For the phen+LPS group，rats were injected with phen(1.6 μmol·kg-1，ip)1 hour before LPS(5 mg·kg-1，iv)treatment.P ＜ 0.05 for phen+LPS group(n=16)vs LPS group(n=16)

2.2 BALF中蛋白濃度的變化 LPS組，LPS注射后6 h，BALF中的蛋白濃度明顯高于Control組(P＜0.05);在phen+LPS組，BALF中蛋白濃度比LPS組降低(P＜0.05);而單獨(dú)注射phen對BALF中的蛋白滲出無影響(Tab 1)。

Tab 1 Effect of phen on protein exudation in BALF and lung wet/dry weight ratio±s，n=6)

Tab 1 Effect of phen on protein exudation in BALF and lung wet/dry weight ratio±s，n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group

Group Protein/g·L-1W/D Control 47.59±4.44 4.39±0.27 phen 49.13±5.98 4.45±0.20 LPS 76.12±5.38* 5.57±0.42*phen+LPS 57.53±5.56*# 4.84±0.29*#

2.3 BALF中 TNF-α和 IL-6濃度的變化 LPS組，BALF中的TNF-α濃度明顯升高，注射LPS后3 h達(dá)峰值，隨后開始下降;而在phen+LPS組，BALF中TNF-α濃度與 LPS組比較降低(P＜0.05，F(xiàn)ig 2A)。同樣，phen+LPS組BALF中的IL-6濃度也明顯低于LPS組(P＜0.05，F(xiàn)ig 2B)。而在phen組，單獨(dú)注射phen對BALF中TNF-α和IL-6的釋放無影響(Fig 2A和2B)。

2.4 肺組織病理變化 注射LPS后6 h肺組織病理切片光鏡觀察，LPS組肺組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡內(nèi)出血較多，肺泡委陷，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)明顯水腫(Fig 3B);而phen+LPS組上述表現(xiàn)均有所減輕，僅肺間隔輕度增寬，無明顯出血，少量炎性細(xì)胞浸潤(Fig 3C)。圖3A為正常肺組織切片。單獨(dú)注射phen，對肺組織結(jié)構(gòu)無影響(Fig 3D)。

2.5 肺濕/干重比值的變化 LPS注射后6 h，肺組織的W/D值明顯高于control組(P＜0.05)。而在相同的時(shí)間點(diǎn)，phen抑制了LPS導(dǎo)致的肺W/D值的增加(P＜0.05)，而單獨(dú)注射phen的W/D值與control組相比，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見Tab 1。

2.6 肺組織中p-Akt的活化 LPS明顯減少胞質(zhì)中p-Akt含量，在LPS組，注射LPS后p-Akt表達(dá)隨時(shí)間延長越來越少，到12 h幾乎無表達(dá)(Fig 4A);提前注射phen在各時(shí)間點(diǎn)均明顯提高p-Akt的表達(dá)(Fig 4B)。各組間Akt表達(dá)沒有變化(Fig 4A，4B)。

3 討論

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。以往研究較多的是 NF-κB 和 MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［7，8］，因?yàn)橐衙鞔_該通路可誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。但由于近年來對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)注，人們發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是保護(hù)肺上皮細(xì)胞和緩解肺部炎癥的重要通路之一［5，9］。

Fig 2 LPS-induced alterations of TNF-α and IL-6 levels in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)from rats and the suppression of phen±s)A:The concentrations of TNF-α in BALF at each time point after LPS administration and the suppression of phen pretreatment.B:The concentrations of IL-6 in BALF at each time point after LPS administration and the suppression of phen pretreatment.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs LPS group

Fig 3 Microscopic findings of lung tissues stained with hematoxylin-eosin(HE，×400)Histopathologic examination of the lungs was performed at 6 h after LPS injection.A:Control group;B:LPS group:edematous changes of alveolar walls，swelling of alveolar epithelial cells，and massive polymorphonuclear infiltration were observed;C:phen+LPS group:less damage was observed compared with the LPS group;D:phen group:no differences were observed compared with control group

Fig 4 The expression of p-Akt in cytoplasm of lung tissues(ˉ±s，n=3 or 4)

PTEN是目前發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因。其編碼的磷酸酶具有蛋白和脂質(zhì)磷酸酶活性，PIP2在PI3K的磷酸化作用下生成PIP3，從而介導(dǎo)Akt的活化，PTEN卻可以發(fā)揮它的磷脂酶活性使PI3K的脂質(zhì)產(chǎn)物PIP3的3位脫磷酸，下調(diào)由PI3K/Akt通路控制的細(xì)胞生長和存活［9］。因此，PI3K和PTEN之間關(guān)鍵的平衡對細(xì)胞存活有重要的影響。而有資料表明PTEN相對較多的分布于分化初期的人肺上皮細(xì)胞［9］。

在本實(shí)驗(yàn)中，在注射LPS之前使用phen特異性抑制PTEN，活化PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能減輕肺實(shí)質(zhì)損傷。與LPS組相比較，這種對LPS-ALI肺實(shí)質(zhì)的保護(hù)導(dǎo)致了存活率的明顯改善。該保護(hù)作用還進(jìn)一步被組織病理學(xué)檢查所證實(shí)。肺組織HE染色顯示，預(yù)先注射phen后，LPS導(dǎo)致的肺組織損傷程度明顯減輕。以上這些均表明，PTEN抑制劑能夠緩解LPS導(dǎo)致的急性肺損傷。

那么，PTEN抑制劑是如何發(fā)揮其保護(hù)作用的呢?肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞共同組成重要的屏障，以維持肺組織穩(wěn)定和肺泡最佳的氣體交換，并限制肺泡內(nèi)液體滲出［10-11］。在本實(shí)驗(yàn)中，注射LPS后，肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障功能明顯受損，從而導(dǎo)致肺泡內(nèi)有大量的蛋白和液體滲出并釋放大量炎性因子，同時(shí)肺組織中p-Akt表達(dá)明顯降低;而預(yù)先使用phen后肺泡內(nèi)滲出和炎性因子釋放明顯減少，可能與活化PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致p-Akt表達(dá)增加，加快了損傷的肺上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障修復(fù)致使?jié)B出減少有關(guān)，該結(jié)果與先前學(xué)者報(bào)道的加速離體肺上皮細(xì)胞機(jī)械性損傷修復(fù)相一致［5，9］。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PTEN抑制劑在LPS導(dǎo)致的ALI中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。這一作用可能與其誘導(dǎo)肺組織中Akt活化，進(jìn)而加快肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障的修復(fù)，減少肺泡內(nèi)蛋白和液體的滲出及炎性因子的釋放有關(guān)。短暫抑制PTEN在人體ALI的詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，并且可以考慮作為一種可能的治療方法來預(yù)防或者治療ALI。

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