ERK 1/2和p38 MAPK介導(dǎo)BAPTA-AM抑制RANKL誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分化的機(jī)制研究

周四桂，袁 茜，潘雪刁，金桂芳，徐立朋

NF-κB受體活化因子配體(RANKL)又稱(chēng)骨保護(hù)素配體(OPGL)、腫瘤壞死因子相關(guān)性活化誘導(dǎo)因子(TRANCE)、破骨細(xì)胞分化因子(ODF)等，RANKL是破骨細(xì)胞(Osteocalst，OC)生成及發(fā)揮骨吸收功能必需的細(xì)胞因子［1－3］。1998 年，Lacey等［2］用重組OPG-Fc融合蛋白作免疫探針發(fā)現(xiàn)在鼠類(lèi)骨髓單核細(xì)胞系32D上有OPG結(jié)合分子的表達(dá)，并將其克隆成功，確認(rèn)為 OPG配體(OPGL)。RANKL可分為膜結(jié)合蛋白型和可溶性蛋白型，這兩種類(lèi)型的RANKL均可與OC前體細(xì)胞表面的RANK受體結(jié)合，從而直接刺激OC的分化［4］。

BAPTA-AM是一種細(xì)胞內(nèi)的快速鈣離子絡(luò)合劑，從而干擾正常Ca2+的釋放和重?cái)z取，阻斷Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5］，由于PKC作為一種依賴(lài)于Ca2+的激酶，其活性也可被BAPTA-AM抑制。目前有關(guān)BAPTA-AM與破骨細(xì)胞的關(guān)系研究尚不完全清楚。為了觀察BAPTA-AM對(duì)RANKL誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的影響，本實(shí)驗(yàn)在M-CSF和RANKL兩種細(xì)胞因子共同存在的條件下，建立體外骨髓誘導(dǎo)破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察BAPTA-AM對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響，并以ERK1/2和p38MAPK為靶點(diǎn)進(jìn)一步探索其發(fā)揮抑制作用的信號(hào)通路機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)4周齡，♀小鼠8只，體質(zhì)量(19±3)g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FCS)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;M-CSF和rhsRANKL均購(gòu)于英國(guó)PeproTech公司;BAPTA-AM和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒均購(gòu)于 Sigma-Aldrich公司;抗 ERK 1/2、p-ERK 1/2、p38MAPK 和p-p38MAPK均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司。

1.3 破骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法 用蒸餾水沖洗鼠體后拉頸脫位處死，75%乙醇浸泡5 min。無(wú)菌條件下分離股骨及肱骨，剪斷兩側(cè)骨骺端，用注射針頭將 RPMI 1640(含100 kU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素，2 mmol·L－1L-谷胺酰氨，10%FCS)輕輕沖洗骨髓腔，吸取上層細(xì)胞懸液，以1×108·L－1的濃度均勻接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加全培養(yǎng)液至1 ml，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)根據(jù)培養(yǎng)液中是否加入 M-CSF(50 μg·L－1)、RANKL(50 mg·L－1)和不同濃度的BAPTA-AM分組。將分組的細(xì)胞混合液移入培養(yǎng)板中并放入培養(yǎng)箱(5%CO2、37℃)中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，培養(yǎng)過(guò)程中每天定期觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。于d 5～d 7進(jìn)行細(xì)胞觀察、計(jì)數(shù)及生化指標(biāo)測(cè)定。

1.4 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 將細(xì)胞玻片固定后，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。以TRAP+多核細(xì)胞(≥3)為破骨細(xì)胞，對(duì)每個(gè)玻片隨機(jī)取5～10個(gè)視野(×200)中的破骨細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 免疫印記法(Western blot)檢測(cè)p-ERK 1/2和p-p38MAPK的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)因素處理后，離心收集。使用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入裂解緩沖液(50 mmol·L－1Tris-HCl，150 mmol·L－1NaCl，0.2 g·L－1NaN3，1 g·L－1SDS，1.0 mmol·L－1PMSF，1 mg·L－1aprotinin，1.0 g·L－1NP40，5.0 g·L－1Na3VO4，1 mg·L－1leupeptin，pH 8.0)振蕩混勻，冰浴30 min，4℃ 12 000×g離心10 min，取上清，即為胞質(zhì)蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PBST洗膜5 min。室溫下用5%脫脂奶粉(PBST溶解)封閉PVDF膜1 h。隨后加入抗 ERK 1/2、p-ERK 1/2、p38MAPK、p-p38MAPK(1 ∶1 000)或抗 β-actin(1∶2 000)4℃孵育過(guò)夜。PBST洗脫3次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h，漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室中曝光到X光片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞活體觀察 由Fig 1可以看出，培養(yǎng)1 h后開(kāi)始出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，大多為體積較小的單核圓形細(xì)胞，大小基本一致，分布比較均勻;培養(yǎng)d 2細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)變化，出現(xiàn)散在的大型細(xì)胞，局部出現(xiàn)細(xì)胞聚集，但各組細(xì)胞密度未見(jiàn)明顯變化;細(xì)胞培養(yǎng)d 3～d 4，各組不規(guī)則細(xì)胞數(shù)量增加，體積增大，形態(tài)演變?yōu)榇髨A形、花瓣形等，有些細(xì)胞出現(xiàn)偽足，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)多核，成為破骨細(xì)胞;培養(yǎng)d 7破骨細(xì)胞形成逐漸達(dá)到高峰，細(xì)胞核大多有3個(gè)或3個(gè)以上。

Fig 1 The observation of mouse BMMs or osteoclasts(200×)

2.2 BAPTA-AM對(duì)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分化的影響 用M-CSF、RANKL和加入不同濃度BAPTA-AM(0.5、1 和 2 μmol·L－1)的 RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓巨噬細(xì)胞7 d，收集誘導(dǎo)分化的骨髓巨噬細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)TRAP陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)在3～10或＞10的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示含有RANKL的陽(yáng)性對(duì)照組骨髓巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)多核，分化成為破骨細(xì)胞。不同濃度的BAPTA-AM對(duì)破骨細(xì)胞的形成具有明顯的抑制作用，且隨著濃度劑量依賴(lài)性地降低 TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，2 μmol·L－1BAPTAAM能使骨髓巨噬細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的數(shù)量較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 The effect of BAPTA-AM on the osteoclastogenesis of BMMs(n=3)

2.3 BAPTA-AM對(duì)RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞存活的影響 Fig 3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RANKL能明顯地誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞(P＜0.05)，而與RANKL組相比，BAPTAAM能明顯地抑制RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞存活(P＜0.05)。

Fig 3The effect of BAPTA-AM on osteoclast survival±s，n=3)Mouse osteoclasts were treated with 2 μmol·L －1BAPTA-AM or vehicle.The medium was then changed and osteoclasts were incubated with RANKL(100 μg·L－1)or vehicle at 37℃ for 24 h.The number of osteoclasts per dish at 24 h was expressed as a percentage of the initial number of osteoclasts in the same dish.Osteoclast survival was significantly greater in cultures treated with RANKL alone than under all other conditions(P＜0.05).*P ＜0.05 vs control.#P ＜0.05 vs sample treated with only RANKL

2.4 BAPTA-AM對(duì)RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞ERK1/2和p38MAPK磷酸化的影響 為了探討B(tài)APTA-AM對(duì)RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞形成和存活的機(jī)制，我們從ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路來(lái)研究BAPTA-AM對(duì)其磷酸化水平的影響，F(xiàn)ig 4結(jié)果顯示，RANKL處理能明顯地誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化(P＜0.01)。而與 RANKL組相比，BAPTA-AM能明顯地抑制RANKL誘導(dǎo)的胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，并隨著濃度增加這種抑制作用更加明顯。

3 討論

Fig 4 Effect of BAPTA-AM on ERK1/2 and p38MAPK phosphorylation stimulated by RANKL(n=3)Protein extracts were prepared after treatment with/without 12.5，25 and 50 μmol·L －1BAPTA-AM for 1 h before incubation with 25 μg·L －1RANKL for 8 h.Immunoblotting assays were performed with an antibody against phosphorylated ERK1/2(p-ERK1/2)，phosphorylated p38 MAPK(p-p38 MAPK)，ERK1/2 and p38 MAPK.In the RANKL alone treatment，the expression of p-ERK1/2 and p-p38 was higher than that of control，and BAPTA-AM inhibited RANKL-induced ERK1/2 and p38 phosphorylation dose-dependently.＊＊P ＜0.01 vs control.##P ＜0.01 vs sample treated with only RANKL

正常骨代謝過(guò)程是一種骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，這一過(guò)程受到體內(nèi)外許多因素的調(diào)控，如年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)狀況、生活習(xí)慣、疾病等。這些方面一旦出現(xiàn)問(wèn)題，均會(huì)導(dǎo)致骨代謝受阻，引發(fā)骨質(zhì)疏松，其本質(zhì)在于骨重建過(guò)程紊亂，即破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成。破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞的單核巨噬細(xì)胞系，其分化過(guò)程中涉及 NF-κB活化受體(RANK)/骨保護(hù)素(OPG)/RANK配體(RANKL)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。RANKL表達(dá)于成骨細(xì)胞表面與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，與巨噬細(xì)胞克隆刺激因子(M-CSF)一起啟動(dòng)破骨細(xì)胞的分化。研究表明M-CSF和RANKL是破骨細(xì)胞形成、分化和成熟過(guò)程中所必須有的兩種細(xì)胞因子［4］。本實(shí)驗(yàn)在原有破骨細(xì)胞骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，成功建立了以M-CSF和RANKL為共同誘導(dǎo)分化因子的破骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，在這種培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)變化符合破骨細(xì)胞特點(diǎn)。

BAPTA-AM是一種細(xì)胞內(nèi)的快速鈣離子絡(luò)合劑，從而干擾正常Ca2+的釋放和重?cái)z取，阻斷Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［5－6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RANKL 誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)多核，分化成為破骨細(xì)胞。不同濃度的BAPTA-AM對(duì)破骨細(xì)胞的形成具有明顯的抑制作用且隨著濃度增加明顯地降低TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。為了進(jìn)一步探討B(tài)APTA-AM對(duì)RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞形成和存活的機(jī)制，我們從ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路［7］來(lái)研究BAPTA-AM對(duì)其磷酸化水平的影響。ERK1/2和p38MAPK是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中經(jīng)典的信號(hào)蛋白分子，MAPK是一類(lèi)由脯氨酸介導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)Ⅷ區(qū)域蘇氨酸、酪氨酸雙位點(diǎn)磷酸化活化，激活的MAPK通過(guò)磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白、其它酶類(lèi)等不同底物來(lái)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過(guò)程，其中ERK主要通過(guò)Ras→Raf→MAPK/ERK 激酶(MAPK/ERK kinase，MEK1/2)被激活，可能與生理性信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，有利于損傷的修復(fù)和細(xì)胞的再生，對(duì)破骨細(xì)胞的形成、生存、分化及刺激骨吸收有重要作用。而p38MAPK則主要參與傷害性應(yīng)激信號(hào)的傳導(dǎo)，與破骨細(xì)胞的生成和凋亡有關(guān)［8－9］。其主要通過(guò)P21激活蛋白激酶(P21-activated kinase，PAK)→混合譜系激酶 (mixed lineage kinase，TAK/ASK/MLK)→MKK3/MKK6被激活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RANKL處理能明顯地誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化。而與RANKL組相比，BAPTAAM能明顯地抑制RANKL誘導(dǎo)的胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，并隨著濃度增加這種抑制作用更加明顯。說(shuō)明Ca2+釋放形成的Ca2+信號(hào)在RANKL誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分化成為破骨細(xì)胞中起著重要作用，促進(jìn)了胞質(zhì) ERK1/2和p38MAPK 的磷酸化水平［10－12］。

綜上所述，Ca2+信號(hào)通路在RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞形成和存活過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，BAPTA-AM作為一種快速高效的Ca2+絡(luò)合劑，明顯地抑制RANKL誘導(dǎo)的胞質(zhì)ERK1/2和p38MAPK的磷酸化水平，在體外可有效地抑制破骨細(xì)胞的形成與分化，延緩骨吸收過(guò)程。

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