人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體sFlt-1胞外區(qū)cDNA在嬰兒雙歧桿菌中的表達(dá)和鑒定

謝 清，張 萌

(四川省紅十字腫瘤醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，四川 成都 610041)

人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體sFlt-1胞外區(qū)cDNA在嬰兒雙歧桿菌中的表達(dá)和鑒定

謝 清，張 萌

(四川省紅十字腫瘤醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，四川 成都 610041)

目的：構(gòu)建攜帶重組基因sFlt-1的嬰兒雙歧桿菌基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)，并觀察其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響。方法：將編碼血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體sFlt-1 胞外區(qū)1-3loop316個氨基酸殘基的cDNA插入到pET32a構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-sFlt-1,轉(zhuǎn)化入嬰兒雙歧桿菌, 轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌，陽性克隆菌經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切鑒定。結(jié)果：得到兩條大小分別與基因sFlt-1及pET32a質(zhì)粒片段大小相符的電泳條帶，PCR檢測到外源性sFlt-1基因已成功導(dǎo)入嬰兒雙歧桿菌，在體外實(shí)驗(yàn)中，重組質(zhì)粒組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，細(xì)胞生長受到明顯抑制，而空質(zhì)粒組細(xì)胞無明顯變化。結(jié)論：成功構(gòu)建攜帶重組基因sFlt-1的嬰兒雙歧桿菌基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；嬰兒雙歧桿菌；sFlt-1

抗腫瘤血管生成治療是近年來抗腫瘤治療研究中的一大熱點(diǎn)，其治療策略大體可分為抗血管生成和血管靶向兩大類[1]，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF) 受體Flt-1 屬酪氨酸蛋白激酶受體家族第三亞型,是分子量約為180kD 的糖蛋白，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分，其中胞外區(qū)負(fù)責(zé)與配體結(jié)合，可特異性與VEGFR2結(jié)合而有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成具有7個免疫球蛋白樣袢( Ig2like loop)，配體結(jié)合域位于氨基端3個loop內(nèi)。

可溶性VEGFR是指VEGFR的胞外片斷，它可游離于血液或組織液，具有抗血管生成的作用?？扇苄訤lt-1 (soluble Flt-1,s Flt-1)即是指KDR的胞外片斷。本文以非致病性嬰兒雙歧桿菌作為抗腫瘤血管生成的靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，構(gòu)建攜帶重組基因sFlt-1的嬰兒雙歧桿菌基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)，并觀察其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1材料大腸桿菌(E.coli)JM109菌株(含質(zhì)粒pET32a)及嬰兒雙歧桿菌2001為本實(shí)驗(yàn)室保種保存；重組質(zhì)粒pcDNA3.1-sFlt-1為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；限制酶、T4 連接酶及Taq DNA 聚合酶購自Promega公司。

1.2方法

1.2.1目的基因片段的擴(kuò)增 引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物: 5’-TGAGAATTCATG GAGAGCAAGG T-3’，下游引物: 5’-GTGCTCGAGTTTTTCATGGACCCT-3’，劃線處為EcoRⅠ與XhoI酶切位點(diǎn)。以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1- sFlt-1,PCR擴(kuò)增條件為94℃45s，68℃45s，72℃60s,共30個循環(huán)，最后延伸10min。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與載體質(zhì)粒pET32a，以EcoRⅠ與XhoI雙酶切，后轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α,提取質(zhì)粒DNA測序正確，并提取質(zhì)粒進(jìn)行PRC及酶切鑒定。

1.2.3重組質(zhì)粒電穿孔法轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌 將新鮮制備的嬰兒雙歧桿菌細(xì)菌懸液、重組質(zhì)粒pET32a-sFlt-1及電擊杯置于冰上預(yù)冷5min，調(diào)節(jié)電穿孔儀至電脈沖為2.0kV，電阻200Ω，電容25μF，電擊完后，迅速取出電擊杯，并加入1ml的MRS液體培養(yǎng)基(含0.05%鹽酸半胱氨酸和0.5mol/L蔗糖)，槍頭混勻后，移至干凈的EP管中，放入?yún)捬醺祝ㄒ曰旌蠚?，置?7℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2.5h，取200μl菌液，用無菌彎頭玻棒將其均勻涂抹在含氨芐青霉素(10μg/ml)的MRS固體培養(yǎng)基平板上(含0.05%鹽酸半胱氨酸和0.5mol/L蔗糖)，置于室溫直至液體被吸收。之后，將平板放進(jìn)厭氧缸，37℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)3～4d。

1.2.4重組陽性克隆株的篩選與鑒定 從Eryr MRS平板上挑選分離良好的單菌落，接種于5ml Eryr MRS液體培養(yǎng)基中，并往液體培養(yǎng)基表面滴加2滴石蠟油，于搖床上37℃振蕩培養(yǎng)(130～150rpm)12～14h。取1ml培養(yǎng)液加入EP管，100℃水中煮5min，4000g離心10min，取上清6μl做PCR。

2 結(jié) 果

2.1目的基因的獲取及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定PCR擴(kuò)增的sFlt-1基因片段長度約為1000bp，與預(yù)計(jì)的大小969bp大小相符，與載體質(zhì)粒pET32a連接后，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α,提取質(zhì)粒，DNA序列分析證實(shí)與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致。重組質(zhì)粒pcDNA3.1- sFlt-1經(jīng)EcoRI及XhoI雙酶切鑒定,得到相應(yīng)片段(見圖1)。

2.2RT-PCR檢測陽性轉(zhuǎn)化菌中sFlt-1基因的表達(dá)以提取的陽性重組嬰兒雙歧桿菌總RNA作RT-PCR(見圖2)。泳道2為RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約969bp的特異性條帶，證明外源基因Flt-1能夠在嬰兒雙歧桿菌中表達(dá)。泳道3是以重組質(zhì)粒pcDNA3.1-sFlt-1為模板擴(kuò)增sFlt-1后經(jīng)瓊脂糖電泳所得的陽性對照條帶。

3 討 論

早在100多年前，就已發(fā)現(xiàn)腫瘤相對于正常組織內(nèi)存在更多的血管[2]。Folkman等早在1971就已提出，可通過阻斷腫瘤血管的生成來抑制腫瘤血管的生長、防止腫瘤的轉(zhuǎn)移[3-4]，腫瘤生長對血管新生的依賴性得到普遍認(rèn)可?？鼓[瘤血管生成作為治療腫瘤的一種方法，是通過阻斷腫瘤周圍形成新生血管、干擾營養(yǎng)腫瘤的血管網(wǎng)使其血供不足[2-5]，以達(dá)到“餓死”腫瘤的目的，其治療策略大體分為抗血管生成和血管靶向兩大類[1]。

實(shí)體瘤代謝的一個重要特點(diǎn)是瘤體內(nèi)部的相對乏氧狀態(tài)，而厭氧菌又具有趨低氧環(huán)境的特性，經(jīng)靜脈途徑給予厭氧菌后，厭氧菌便靶向定植于實(shí)體瘤，并在腫瘤局部開始增生繁殖[6-7]。嬰兒雙歧桿菌是一類非致病性革蘭氏陽性厭氧菌，寄居于人類及其他哺乳動物的低位小腸和大腸中，具保護(hù)宿主健康的作用，以它作為基因靶向轉(zhuǎn)移載體的實(shí)驗(yàn)研究開展得非常多。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pET32a-sFlt-1，再利用電穿孔法將重組質(zhì)粒pET32a-sFlt-1轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌，篩選出陽性菌落，提取其質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時對提取出的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳得到兩條大小分別約為969bp、5.9kb的片段，分別與sFlt-1基因和pET32a質(zhì)粒大小相符，說明重組質(zhì)粒pET32a-sFlt-1已成功導(dǎo)入嬰兒雙歧桿菌，為進(jìn)一步探討嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)的可溶性VEGFR基因轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在體內(nèi)的抗血管生成作用奠定了基礎(chǔ)。

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[編輯] 一 凡

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A

1673-1409(2010)02-R016-02

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.02.006

2010-03-01

謝清(1967-)，女，重慶沙坪壩人，主治醫(yī)師，從事臨床內(nèi)科工作。