基于滿秩平行因子分析方法研究左氧氟沙星兩種結(jié)構(gòu)型體的熒光光譜及其與酸堿度的關(guān)系

郭嘉偉, 謝洪平

(1第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析與分析化學(xué)教研室, 重慶 400038; 2蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室; *通訊作者:E-mail:breakhp@163.com)

左氧氟沙星,以其抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、高效等特點(diǎn),是目前最受歡迎的氟喹諾酮類抗菌藥物之一。其分子結(jié)構(gòu)存在有 C-4羰基氧,C-3羧基,另外還有哌嗪基團(tuán),因此其理化性質(zhì)必然會(huì)受到介質(zhì)的理化性質(zhì)和pH的影響。隨著介質(zhì) pH的改變,左氧氟沙星會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)構(gòu)變化,結(jié)構(gòu)變化又會(huì)使其熒光光譜發(fā)生改變[1]。近年來,已經(jīng)有報(bào)道利用一些熒光分析方法對(duì)左氧氟沙星在不同 pH環(huán)境中的不同結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行了研究[2-5],但是這些研究?jī)H能獲取不同結(jié)構(gòu)形態(tài)藥物的混合物光譜,往往進(jìn)行一些間接的推論,未能闡述這些不同結(jié)構(gòu)形態(tài)的具體變化過程,同時(shí)也不能直接獲得各結(jié)構(gòu)形態(tài)的光譜和濃度變化信息。本文利用熒光分光光度法對(duì)不同pH值下的左氧氟沙星溶液進(jìn)行三維熒光分析,并以滿秩平行因子分析方法(full rank parallel factor analysis,Full-PARAFAC)對(duì)相應(yīng)的三維陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行分辨,達(dá)到對(duì)不同 pH環(huán)境下左氧氟沙星各種結(jié)構(gòu)型體熒光光譜和濃度變化進(jìn)行研究的目的,為左氧氟沙星的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)研究提供更科學(xué)的信息。

1 儀器與試劑

左氧氟沙星(含量 99%,蘇州長(zhǎng)征制藥廠提供),磷酸二氫鉀,磷酸氫二鉀,氫氧化鈉,鹽酸 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。所有藥品均為分析純,雙蒸水(自制)。

LS-55熒光分光光度計(jì)(Perkin Elemer公司),pHS-3TC精密數(shù)顯酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 樣本制備 以左氧氟沙星、KH2PO4,K2HPO4,NaOH和HCl(0.01 mol/L)配制了 pH值分別為2.78,3.54,4.21,4.71,5.16,5.76,6.57,6.84,7.02,7.26,7.43,7.62,7.83的13個(gè)待測(cè)樣本。

2.2 光譜條件 對(duì)所配制的不同 pH值的待測(cè)樣本分別掃描其三維熒光譜圖,光譜條件為:激發(fā)波長(zhǎng)290-360 nm,步長(zhǎng)增加 5 nm;發(fā)射波長(zhǎng)410-560 nm,掃描次數(shù) 15次;激發(fā)與發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm。

3 結(jié)果

3.1 左氧氟沙星在不同 pH值下的三維熒光光譜在樣品的三維熒光譜圖中可以觀察到,隨著 p H值的改變,左氧氟沙星溶液發(fā)生了熒光特征變化,熒光發(fā)射峰發(fā)生了明顯的藍(lán)移(見圖1),此現(xiàn)象說明在不同 pH環(huán)境下此藥物可能存在不同的結(jié)構(gòu)型體?；谖墨I(xiàn)[3],發(fā)現(xiàn)它們可能是氫鍵結(jié)構(gòu)(the hydrogen bond structure,HDS)和雙極離子結(jié)構(gòu)(the dipole ion structure,DIS)兩種型體,但由于兩種結(jié)構(gòu)型體之間存在顯著的化學(xué)平衡和弱化學(xué)鍵的結(jié)構(gòu),難于分離,當(dāng)然更無從得到其純光譜。

圖1 左氧氟沙星在pH 2.78,pH 5.16和pH 7.83溶液中的三維熒光光譜Fig 1 The three dimensional fluorescence spectrum of levofloxacin in the pH 2.78,pH 5.16and p H 7.83 solution

3.2 Full-PARAFAC分辨結(jié)果 用 Full-PARAFAC方法對(duì)三維數(shù)據(jù)陣列進(jìn)行分辨,得到了左氧氟沙星兩個(gè)結(jié)構(gòu)型體的光譜(圖2)以及相應(yīng)的濃度變化曲線(圖3)。圖2中 290-360 nm范圍內(nèi)的光譜為激發(fā)光譜,400-560 nm范圍內(nèi)的光譜為發(fā)射光譜。從圖3可以觀察到,兩種結(jié)構(gòu)型體濃度之和的變化趨勢(shì)依據(jù) pH值可分為三個(gè)階段:分別為pH2.78-5.76,pH5.76-7.02和pH7.02-7.83。

圖2 左氧氟沙星 HDS(●)和DIS(▲)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(實(shí)線:分辨光譜;虛線:p H值 2.78的實(shí)際光譜)Fig 2 The excitation and emission spectra of HDS(●)and DIS(▲)for levofloxacin(line:resolution spectra;dash line:real spectra of p H 2.78)

圖3 HDS(●)、DIS(▲)和HSD+DIS(■)的濃度變化曲線Fig 3 The concentration variation curves of HDS(●),DIS(▲)and HDS+DIS(■)

4 討論

4.1 三維光譜數(shù)據(jù)處理 通過掃描獲得了 13個(gè)樣本的激發(fā)-發(fā)射光譜,組成了(15′292′13)的三維數(shù)組,但由于其發(fā)射光譜數(shù)據(jù)過于緊密,將導(dǎo)致數(shù)據(jù)處理量大大增加,而信息量并未顯著提高,因此,本文參照激發(fā)光譜,將5 nm的間隔也用于發(fā)射光譜,從而使三維數(shù)組的維數(shù)從(15′292′13)降低為(15′29′13),并以此數(shù)據(jù)進(jìn)行三維分辨。

4.2 HDS和DIS的熒光光譜及濃度變化 由于在不同的pH環(huán)境中,左氧氟沙星會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)構(gòu)變化,偏酸性條件下,分子中的羧基氧結(jié)合質(zhì)子,并與 4位 C羰基氧相連,形成氫鍵,此時(shí)溶液中 HDS結(jié)構(gòu)型體占主要比例;而隨著 pH值的升高,分子內(nèi)氫鍵逐漸被破壞,具有氫鍵結(jié)構(gòu)的HDS型體逐漸減少,以雙極離子形式存在的結(jié)構(gòu)型體濃度逐漸升高。從圖3可以看出,與圖2光譜 1相對(duì)應(yīng)組分的濃度隨 pH的升高逐漸減少,而光譜 2組分的濃度卻隨pH的升高逐漸增加。因此,在所得到的左氧氟沙星兩個(gè)組分的純光譜中,光譜 1應(yīng)為HDS結(jié)構(gòu)型體的激發(fā)與發(fā)射光譜,而光譜 2為DIS結(jié)構(gòu)型體的純光譜。為了說明以上的結(jié)論,對(duì)所得 HDS的發(fā)射光譜與實(shí)際光譜進(jìn)行了比對(duì)。當(dāng) pH為2.78時(shí),HDS型體的濃度最高,而 DIS型體的濃度幾乎為零,因此,這時(shí)的實(shí)際光譜就應(yīng)當(dāng)為型體 HDS的熒光光譜。在 pH2.78的三維熒光光譜圖中,取最大激發(fā)/發(fā)射對(duì)294 nm/501 nm處的譜線數(shù)據(jù)歸一化后,與分辨得到的結(jié)構(gòu)型體 HDS的發(fā)射光譜進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)二者完全重合(見圖2)。從而進(jìn)一步證明了上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)論,亦間接證明了分辨圖中的第二條曲線應(yīng)為結(jié)構(gòu)型體 DIS的熒光光譜。

在獲取 HDS和DIS兩種型體純光譜的同時(shí),也得到了兩者的濃度變化趨勢(shì)。由圖3可知,隨著 p H值的升高,以氫鍵形式(HDS)存在的結(jié)構(gòu)型體逐漸減少,而以雙極離子形式(DIS)存在的結(jié)構(gòu)型體逐漸增多。HDS和DIS兩種結(jié)構(gòu)型體的總量也逐漸減少。同時(shí) HDS和DIS的總濃度的變化呈現(xiàn)三個(gè)階段,即在 pH2.78-5.76范圍內(nèi)穩(wěn)定,在 pH5.76-7.02范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,而在 pH7.02-7.83范圍內(nèi)明顯下降。

5 結(jié)論

本文對(duì)不同 pH環(huán)境下左氧氟沙星的三維熒光光譜進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在 pH值 2.78-7.83的范圍內(nèi),左氧氟沙星的三維熒光光譜會(huì)發(fā)生規(guī)律性的變化:2.78≤pH≤5.16時(shí),熒光發(fā)射峰逐漸藍(lán)移,熒光強(qiáng)度基本保持不變;5.16＜pH≤7.83時(shí),熒光峰大幅度藍(lán)移,熒光強(qiáng)度逐漸降低。在溶液中,當(dāng) p H值發(fā)生改變時(shí),左氧氟沙星存在著不同結(jié)構(gòu)型體之間的離解平衡,因此,利用 Full-FARAFAC分析方法得出了 pH值 2.78-7.83范圍內(nèi)兩種結(jié)構(gòu)型體 HDS和DIS的純熒光光譜和濃度變化曲線,兩種結(jié)構(gòu)型體的濃度之和變化呈現(xiàn)出三個(gè)階段:p H2.78-5.76范圍內(nèi)穩(wěn)定,pH5.76-7.02范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,pH 7.02-7.83范圍內(nèi)明顯下降?；谘芯拷Y(jié)論可知,在生理 pH環(huán)境中,左氧氟沙星應(yīng)當(dāng)也存在 HDS和DIS這兩種結(jié)構(gòu)型體,隨著 pH的變化,這兩者在體內(nèi)的濃度比例亦會(huì)產(chǎn)生變化,而本文中 HDS和DIS兩種結(jié)構(gòu)型體純光譜的獲得,即相當(dāng)于獲得了兩種結(jié)構(gòu)型體的對(duì)照品,通過對(duì)分析結(jié)果中的光譜進(jìn)行比對(duì),不僅使生物樣品中左氧氟沙星兩種結(jié)構(gòu)組分的檢測(cè)和濃度測(cè)定成為可能,更對(duì)左氧氟沙星藥物代謝和動(dòng)力學(xué)研究提供了更可靠的信息支持。

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