• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PCR方法特異性鑒定獅源性制品

    2010-11-18 06:29:18徐君怡曹際娟
    中國動(dòng)物檢疫 2010年7期
    關(guān)鍵詞:骨粉特異性引物

    徐君怡,曹際娟,于 珂,徐 楊

    (遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧大連 116015)

    地球上目前存在的食肉動(dòng)物大概有11個(gè)科,而最有特點(diǎn)并最重要的就是貓科動(dòng)物。獅,俗稱獅子,就是一種生存在非洲和亞洲的大型貓科動(dòng)物。獅屬于哺乳綱(Mammalia),食肉目(Carnivora),貓科(Felidae),豹屬(Panthera),獅種(P.leo)。獅種中約有13~14個(gè)亞種,其中,歐洲獅、巴巴里獅、斑點(diǎn)獅、開普獅、喀啦哈里獅等五個(gè)亞種已經(jīng)在地球上絕跡,剩下的大部份亞種都生活在薩哈拉沙漠南的非洲[1]。

    為了野生動(dòng)物貿(mào)易能夠持續(xù)發(fā)展,各國制定了相應(yīng)的野生動(dòng)物保護(hù)法規(guī),禁止瀕危動(dòng)物的捕殺和貿(mào)易。對一些受到絕滅威脅的物種限制其貿(mào)易量,以防止因狩獵和貿(mào)易對野生動(dòng)物生存和持續(xù)利用造成威脅。國際上于1975年簽署了《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約(CITES)》,我國于1981年加入該公約。盡管公約的成員國已達(dá)160個(gè),野生動(dòng)物非法狩獵和野生動(dòng)物走私活動(dòng)在世界各地仍非常猖獗,繼續(xù)威脅著野生動(dòng)物的生存。一些對獅虎豹皮和器官或制品有傳統(tǒng)需求的民族通過新近的發(fā)展獲得了新的經(jīng)濟(jì)水平,使得他們有足夠的財(cái)力來獲得摯愛的皮革、器官及其制品,這種需求極大地刺激了貓科動(dòng)物的非法貿(mào)易,而國際間監(jiān)管、執(zhí)法艱難讓保護(hù)力量顯得過于蒼白。

    在野生動(dòng)物取證過程中,有些情況下其產(chǎn)品經(jīng)加工處理后失去了可辨認(rèn)的形態(tài)特征,使獅產(chǎn)品的鑒定工作十分困難。為了更有效地加強(qiáng)獅的保護(hù)工作,建立一種可以對獅DNA進(jìn)行特異性檢測的準(zhǔn)確性高、實(shí)用性強(qiáng)的方法,從分子水平對可疑來自于獅的樣品(例如食品、藥品、皮毛等)進(jìn)行特異性檢測鑒定,都是十分急需和必要的。有關(guān)獅DNA的特異性檢測研究,在國外僅見于Wetton等對貓科動(dòng)物骨DNA進(jìn)行特異性檢測的相關(guān)報(bào)道。國內(nèi)對于該領(lǐng)域的研究幾乎未見報(bào)道。本研究通過篩選獅與其它動(dòng)物在線粒體細(xì)胞色素b(Cyt b)基因片段的堿基差異合成特異引物,經(jīng)過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳,達(dá)到了特異性檢測鑒定獅DNA的目的,并由此建立了一種靈敏、特異、簡便、快速、穩(wěn)定性好的獅DNA檢測方法。

    1 研究方法

    1.1 樣品種類及來源

    本研究所用動(dòng)物源性實(shí)驗(yàn)樣品及其來源見表1,其中獅、虎、豹、熊等珍貴動(dòng)物血液、毛發(fā)標(biāo)本由大連森林動(dòng)物園動(dòng)物飼養(yǎng)研究保護(hù)基地提供,亞洲獅肉為因病死亡動(dòng)物標(biāo)本,經(jīng)遼寧省林業(yè)局批準(zhǔn)由大連森林動(dòng)物園動(dòng)物飼養(yǎng)研究保護(hù)基地提供。為確保樣品來源明確可靠,所采集的各種動(dòng)物的毛發(fā)樣品均直接取自于動(dòng)物體表或單獨(dú)飼養(yǎng)的籠舍。

    ?

    1.2 儀器

    高速離心機(jī) 5804(Eppendorf,德國),普通 PCR 儀,(PE24000,美國),核酸蛋白分析儀(Beckman DU640),恒溫干燥箱(SANYO mov-213F,日本)。

    1.3 引物合成

    根據(jù)獅與其它多種貓科動(dòng)物和哺乳動(dòng)物mtDNA細(xì)胞色素 b基因序列的差異,及引物設(shè)計(jì)有關(guān)原則[2-4],設(shè)計(jì)合成引物。引物序列由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列為F:5'-CAAACCTGAATGGTACTTCCTA-3',R:5'-AGATGGGTATTAGGATTA GAAGA-3'。

    1.4 樣品制備

    稱約100 g獅的肌肉組織,切碎,于120℃烘烤過夜,用組織研磨器研磨成粉末狀。將獅肉粉和牛肉骨粉樣品進(jìn)行混合以得到系列百分比(100%,10%,1%,0.5%,0.1%)的獅肉粉和牛肉骨粉混合物。

    1.5 模板DNA制備

    提取血液類試驗(yàn)樣品基因組DNA用的Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司,貨號D9081。其它組織類和骨粉類樣品采用動(dòng)物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司,貨號DP323-03。從動(dòng)物毛中提取總DNA主要參照公安部物證鑒定中心人的毛發(fā)提取方法進(jìn)行[5]。

    1.6 PCR擴(kuò)增條件

    反應(yīng)采用25μL體系,按下列組分配置PCR反應(yīng)液:10×PCR緩沖液2μL、引物(10μmol/L)各1μL、dNTP(10 mmol/L)2μL、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2μL、模板 DNA 1μL,加dH2O補(bǔ)足25μL。反應(yīng)條件如下:94℃ 3 min;94℃ 1 min,66℃1 min,72 ℃1 min,35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min結(jié)束反應(yīng);4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

    1.7 PCR檢測的特異性分析

    以表1中所列各物種的基因組DNA為模板,按照1.6 PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行獅源性制品的PCR檢測鑒定特異性試驗(yàn)。

    1.8 PCR檢測的靈敏度分析

    將1.4中制備的獅肉粉和牛肉骨粉系列百分比(100%,10%,1%,0.5%,0.1%)混合物,按照1.5模板DNA制備中的骨粉DNA提取方法進(jìn)行混合物基因組DNA的提取。系列混合物DNA用于檢測靈敏度分析。

    2 結(jié)果

    2.1 肌肉和血液樣品中PCR檢測特異性試驗(yàn)

    取表1中所列的17種血液、組織和骨粉類樣品的DNA進(jìn)行PCR檢測。獅種特異性檢測結(jié)果的PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖1所示。試驗(yàn)結(jié)果顯示,獅種中亞洲獅亞種的血液、肌肉組織和毛發(fā)DNA樣本,東非獅亞種的血液DNA樣本經(jīng)過PCR擴(kuò)增,得到陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。而虎、豹、熊的6種血液DNA樣本,牛、羊、馬、豬、狗、兔、驢、鹿等8種哺乳動(dòng)物骨粉DNA樣本以及空白水對照的檢測結(jié)果均為陰性。上述結(jié)果表明:試驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物為獅DNA的特異性擴(kuò)增引物,而且對來自于不同個(gè)體和不同組織的DNA具有同樣的擴(kuò)增效果。

    2.2 毛干中PCR檢測特異性試驗(yàn)

    對亞洲獅、東北虎、金錢豹、波斯貓脫落毛發(fā)進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增。圖2顯示僅亞洲獅樣本出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶,而東北虎、金錢豹和波斯貓的毛發(fā)檢測結(jié)果均為陰性。上述結(jié)果可證明引物僅對獅特異。

    2.3 靈敏度試驗(yàn)

    將1.4中制備的獅肉粉和牛肉骨粉系列百分比(100%,10%,1%,0.5%,0.1%)混合物,按照1.5模板DNA制備中的骨粉DNA提取方法進(jìn)行混合物基因組DNA的提取。該系列的混合物DNA用于進(jìn)行檢測靈敏度分析。按照1.6 PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示,使用1.6中的擴(kuò)增條件,可在含量為100%獅肉粉、10%獅肉粉、1%獅肉粉、0.5%獅肉粉中擴(kuò)增出特異性的PCR擴(kuò)增條帶(圖3)。表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性PCR引物可檢出骨粉中0.5%的獅源成分。

    3 討論

    檢測鑒定獅屬制品可靠的反應(yīng)體系建立在合適的基因片段選擇上,所選的基因必需種屬特異性強(qiáng),而在物種內(nèi)變異性要小。為了選擇一個(gè)合適的鑒定獅的基因片段,我們使用了歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)庫(gene databanks,EMBL),比較其中足夠多的種間數(shù)據(jù)。在一些侯選基因片段中,選擇了線粒體細(xì)胞色素b(Cyt b)基因片段。在互聯(lián)網(wǎng)上數(shù)據(jù)比對的結(jié)果表明,這段基因序列有足夠的特異性可以滿足設(shè)計(jì)種屬特異性的引物對。線粒體細(xì)胞色素b(Cyt b)基因片段在脊椎動(dòng)物中有很高的變異性。這里我們所設(shè)計(jì)的用來定性檢測獅源物質(zhì)的引物,在獅血、獅肉、獅毛樣品中均可以出現(xiàn)特異性PCR擴(kuò)增條帶,而且對來自于不同個(gè)體和不同組織的DNA具有同樣的擴(kuò)增效果。其他14種非獅源樣品(虎、豹、熊、牛、羊、馬、豬、狗、兔、驢、鹿)PCR反應(yīng)中沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。

    本研究所建立的對獅DNA進(jìn)行特異性檢測方法,是國內(nèi)少數(shù)正在進(jìn)行的獅 DNA檢測方法的研究,除具有高特異性、靈敏性外,因其具有簡便易行、快速、成本低等的特點(diǎn)而更具有實(shí)用性。此方法為海關(guān)、動(dòng)植物檢疫以及動(dòng)物保護(hù)組織提供了快速檢測鑒定獅制品的有效方法。

    [1]Bauer H,Nowell K,Packer C.Panthera leo[M].3rd ed.UK:IUCN Red List of Threatened Species,2008.

    [2]Driscoll C A,Menotti-Raymond M,Nelson G,et al.Genomic microsatellites as evolutionary chronometers:a test in wild cats[J].Genome Res,2002,12:414–423.

    [3]Burger J,Rosendahl W,Loreille O,et al.Molecular phylogeny of the extinct cave lion Panthera leo spelaea[J].Mol Phylogenet Evol,2004,30:841–849.

    [4]Dubach J,Patterson B,Briggs M,et al.Molecular genetic variation across the southern and eastern geographic ranges of the African lion Panthera leo[J].Cons Genet,2005,6(1):15–24.

    [5]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析 [M].北京:中國人民公安大學(xué)出版社,2002:53.

    猜你喜歡
    骨粉特異性引物
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    骨粉加工技術(shù)
    微粉碎骨粉對火腿腸食用品質(zhì)的影響
    精確制導(dǎo) 特異性溶栓
    PRF聯(lián)合珊瑚骨粉在前牙美學(xué)區(qū)拔牙位點(diǎn)保存的臨床研究
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
    重復(fù)周圍磁刺激治療慢性非特異性下腰痛的臨床效果
    91久久精品国产一区二区成人| 国产毛片a区久久久久| 成人av一区二区三区在线看| 草草在线视频免费看| 日本免费a在线| 简卡轻食公司| 日韩大尺度精品在线看网址| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久亚洲精品不卡| 日本 欧美在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产伦精品一区二区三区四那| av.在线天堂| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲黑人精品在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲无线观看免费| 成人av一区二区三区在线看| 综合色av麻豆| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成人国产麻豆网| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产精品野战在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99在线人妻在线中文字幕| 成人无遮挡网站| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久久久久久久久成人| 免费看a级黄色片| 久久久久久久午夜电影| aaaaa片日本免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 99热网站在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 国产av一区在线观看免费| 特级一级黄色大片| 色噜噜av男人的天堂激情| 日本a在线网址| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩欧美在线乱码| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一夜夜www| 成年女人毛片免费观看观看9| 在线播放无遮挡| 成人国产一区最新在线观看| 18禁在线播放成人免费| 国产视频内射| 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜福利18| av在线天堂中文字幕| 韩国av在线不卡| 国产在线男女| 最好的美女福利视频网| 偷拍熟女少妇极品色| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲内射少妇av| 一本一本综合久久| 联通29元200g的流量卡| 国产男靠女视频免费网站| 男女边吃奶边做爰视频| 精品人妻熟女av久视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 又紧又爽又黄一区二区| 国产免费一级a男人的天堂| 国产乱人视频| 精品久久久久久,| 色吧在线观看| 国产av不卡久久| 午夜福利在线观看吧| 日本爱情动作片www.在线观看 | 真人一进一出gif抽搐免费| aaaaa片日本免费| 黄色欧美视频在线观看| 看免费成人av毛片| 一级黄色大片毛片| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久性生活片| 久久人人精品亚洲av| 欧美一级a爱片免费观看看| 人妻久久中文字幕网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲最大成人中文| 久久精品91蜜桃| 2021天堂中文幕一二区在线观| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美激情在线99| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久久久久久久久丰满 | 午夜福利在线在线| 嫩草影院入口| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日韩一本色道免费dvd| a级毛片免费高清观看在线播放| 午夜激情欧美在线| 免费av观看视频| 国产精品无大码| 欧美激情在线99| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 神马国产精品三级电影在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产 一区 欧美 日韩| 动漫黄色视频在线观看| 嫩草影院精品99| 性欧美人与动物交配| 看免费成人av毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精华一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 久久久国产成人免费| 成人特级av手机在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 日本a在线网址| 国产真实乱freesex| 亚洲美女搞黄在线观看 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日本黄大片高清| 婷婷色综合大香蕉| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品女同一区二区软件 | 长腿黑丝高跟| 久久久久性生活片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 免费高清视频大片| 久久草成人影院| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 99久久精品热视频| 三级毛片av免费| 内射极品少妇av片p| 亚洲美女视频黄频| 亚洲人与动物交配视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 88av欧美| 国产单亲对白刺激| 国产午夜福利久久久久久| 淫秽高清视频在线观看| 国产综合懂色| 搡老岳熟女国产| 久久久久国内视频| 中文资源天堂在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 看十八女毛片水多多多| 舔av片在线| 精品久久久久久成人av| 日韩欧美国产一区二区入口| 一边摸一边抽搐一进一小说| 特级一级黄色大片| 国产一区二区在线av高清观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费人成在线观看视频色| 国产精品爽爽va在线观看网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 99热精品在线国产| 欧美不卡视频在线免费观看| 午夜福利在线在线| 精品久久国产蜜桃| 毛片女人毛片| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美+日韩+精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精华一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 色综合色国产| 国产一区二区在线观看日韩| 69人妻影院| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产伦在线观看视频一区| 搡老岳熟女国产| 久久九九热精品免费| 在线播放无遮挡| 少妇丰满av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲成人久久爱视频| 欧美zozozo另类| 成人性生交大片免费视频hd| av专区在线播放| 国产精品一区二区性色av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美最黄视频在线播放免费| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 九九在线视频观看精品| 久久久久久九九精品二区国产| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 无人区码免费观看不卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美最新免费一区二区三区| 黄片wwwwww| 岛国在线免费视频观看| 99久国产av精品| 中文资源天堂在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久精品大字幕| 国产视频一区二区在线看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 成人二区视频| 91在线观看av| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费电影在线观看免费观看| 在现免费观看毛片| 白带黄色成豆腐渣| 久久久久久国产a免费观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 色av中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av在线| 成人无遮挡网站| av在线亚洲专区| 亚洲av美国av| 免费黄网站久久成人精品| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本一二三区视频观看| 免费无遮挡裸体视频| 九九热线精品视视频播放| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| av黄色大香蕉| 99视频精品全部免费 在线| 97超视频在线观看视频| 午夜福利在线观看吧| 91麻豆av在线| 亚洲欧美日韩东京热| 久久人人精品亚洲av| 日韩欧美免费精品| 中出人妻视频一区二区| 成人国产综合亚洲| 国产精品福利在线免费观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久国内视频| 国产 一区 欧美 日韩| 国产熟女欧美一区二区| 深夜精品福利| 午夜爱爱视频在线播放| 天堂影院成人在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 午夜精品一区二区三区免费看| 免费无遮挡裸体视频| 一进一出好大好爽视频| 简卡轻食公司| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲av成人av| 久久草成人影院| 国内精品美女久久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美高清性xxxxhd video| 不卡一级毛片| 日韩欧美免费精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲美女黄片视频| 亚洲av一区综合| 成人二区视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 精品国产三级普通话版| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品成人久久久久久| а√天堂www在线а√下载| 久久精品国产亚洲av天美| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美区成人在线视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人一区二区视频在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成人亚洲精品av一区二区| 国产熟女欧美一区二区| 久久精品国产自在天天线| 毛片一级片免费看久久久久 | 日韩国内少妇激情av| 国产免费av片在线观看野外av| 男人和女人高潮做爰伦理| 少妇的逼水好多| 久久久久久伊人网av| 欧美在线一区亚洲| 黄色丝袜av网址大全| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产高清不卡午夜福利| 高清日韩中文字幕在线| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲国产精品sss在线观看| 禁无遮挡网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 日本 欧美在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 在线播放国产精品三级| 久久热精品热| 岛国在线免费视频观看| 精品久久久噜噜| 成人国产一区最新在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 九色国产91popny在线| 日韩人妻高清精品专区| 久久6这里有精品| 中文在线观看免费www的网站| 久久精品91蜜桃| 综合色av麻豆| 成人二区视频| 1000部很黄的大片| 精品久久国产蜜桃| 亚洲人成网站在线播| ponron亚洲| 日本a在线网址| 免费在线观看日本一区| 1000部很黄的大片| 国产精品久久视频播放| netflix在线观看网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 日日啪夜夜撸| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲,欧美,日韩| 国产一区二区在线观看日韩| 国产亚洲av嫩草精品影院| 91狼人影院| 99热只有精品国产| 午夜免费激情av| 黄色配什么色好看| 男女边吃奶边做爰视频| 极品教师在线视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美日韩乱码在线| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日日啪夜夜撸| 一区二区三区免费毛片| 国产精品一区二区免费欧美| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久色成人| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 亚洲色图av天堂| 床上黄色一级片| 日本黄色片子视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人特级av手机在线观看| 又爽又黄a免费视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在线观看午夜福利视频| 可以在线观看毛片的网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲性久久影院| 亚洲av美国av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产成人一区二区在线| 久久久久久久午夜电影| av黄色大香蕉| 日本色播在线视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 婷婷色综合大香蕉| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲国产色片| 国产熟女欧美一区二区| 日本免费a在线| 国产色婷婷99| 91av网一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品永久免费网站| 精品人妻视频免费看| 国产69精品久久久久777片| 少妇高潮的动态图| 在线观看美女被高潮喷水网站| 窝窝影院91人妻| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久精品国产亚洲网站| 永久网站在线| 在线观看午夜福利视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本 av在线| av女优亚洲男人天堂| 日本熟妇午夜| 久久人人爽人人爽人人片va| 校园春色视频在线观看| 成人三级黄色视频| 精品无人区乱码1区二区| 日本-黄色视频高清免费观看| а√天堂www在线а√下载| netflix在线观看网站| 99久久精品热视频| 51国产日韩欧美| 在线观看免费视频日本深夜| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品人妻久久久久久| 久久中文看片网| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品在线观看二区| 国产欧美日韩一区二区精品| 黄色日韩在线| 两个人视频免费观看高清| 中文字幕av在线有码专区| 精品午夜福利在线看| 精品久久久久久成人av| av国产免费在线观看| 99久国产av精品| 国产爱豆传媒在线观看| 日本一二三区视频观看| 精品福利观看| 69人妻影院| 国产成人一区二区在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 男人舔女人下体高潮全视频| 两人在一起打扑克的视频| 午夜福利高清视频| 一区二区三区免费毛片| 亚洲最大成人中文| 久久久久久大精品| 精品久久久噜噜| 免费av毛片视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 最近中文字幕高清免费大全6 | 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 悠悠久久av| 日本 欧美在线| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 一级黄色大片毛片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品久久久久久成人av| 最好的美女福利视频网| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品一区二区性色av| 日本一二三区视频观看| 亚洲中文字幕日韩| 日本一二三区视频观看| 在线a可以看的网站| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 真人做人爱边吃奶动态| 国产黄a三级三级三级人| 免费观看精品视频网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品久久久久久久久亚洲 | 国产视频一区二区在线看| 久久6这里有精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| or卡值多少钱| 中文字幕久久专区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日本三级黄在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产日本99.免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产伦在线观看视频一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 啦啦啦韩国在线观看视频| 精品乱码久久久久久99久播| 久久国产精品人妻蜜桃| 我的女老师完整版在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 村上凉子中文字幕在线| 久久精品国产亚洲网站| 日韩人妻高清精品专区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲 国产 在线| 国内精品宾馆在线| 在线天堂最新版资源| 亚洲国产精品成人综合色| 免费看光身美女| 久久6这里有精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 91在线观看av| 欧美日韩乱码在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 午夜爱爱视频在线播放| 精品一区二区三区人妻视频| 日韩欧美精品免费久久| 日本成人三级电影网站| 久久久久国内视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 中亚洲国语对白在线视频| 国产老妇女一区| 久久九九热精品免费| 一区二区三区高清视频在线| videossex国产| 欧美最新免费一区二区三区| 男女视频在线观看网站免费| 国产毛片a区久久久久| 久久午夜福利片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 高清毛片免费观看视频网站| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲欧美日韩高清专用| 91久久精品电影网| 国产精华一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| 97热精品久久久久久| 欧美日韩黄片免| 亚洲人成伊人成综合网2020| 人人妻人人澡欧美一区二区| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲专区中文字幕在线| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品成人久久久久久| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲18禁久久av| 99热这里只有是精品50| 亚洲精品色激情综合| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久精品综合一区二区三区| 国产成人a区在线观看| 精品人妻视频免费看| 夜夜夜夜夜久久久久| 一a级毛片在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本一二三区视频观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲色图av天堂| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲中文日韩欧美视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 波多野结衣巨乳人妻| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美人与善性xxx| 亚洲av熟女| 国产精品98久久久久久宅男小说| www.www免费av| 欧美日韩黄片免| 国产麻豆成人av免费视频| 国产一区二区三区av在线 | 日韩欧美三级三区| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费在线观看日本一区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 日本 欧美在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 免费在线观看成人毛片| 午夜福利18| 亚洲人成网站在线播| 高清日韩中文字幕在线| 日韩大尺度精品在线看网址| or卡值多少钱| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 丝袜美腿在线中文| 欧美区成人在线视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国内精品美女久久久久久| 国产美女午夜福利| 波多野结衣高清无吗| 91精品国产九色| 久久久成人免费电影| 久久久久久久久久久丰满 | 国产淫片久久久久久久久| 精品久久久久久久久亚洲 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日本一本二区三区精品| 日韩av在线大香蕉| 国产av在哪里看| 亚洲三级黄色毛片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久人人精品亚洲av| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 嫩草影院入口| 亚洲欧美日韩无卡精品|