響應(yīng)面法優(yōu)化黃孢原毛平革菌產(chǎn)多糖培養(yǎng)基的研究

許艷艷，張朝暉

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

響應(yīng)面法優(yōu)化黃孢原毛平革菌產(chǎn)多糖培養(yǎng)基的研究

許艷艷，張朝暉*

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

將Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法相結(jié)合，對(duì)影響黃孢原毛平革菌（Phanerchaete chrysoprium）生產(chǎn)多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度、酒石酸銨濃度和初始pH與多糖產(chǎn)量存在顯著的相關(guān)性，采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，得到黃孢原毛平革菌產(chǎn)多糖的最佳工藝條件：葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.4g/L，大量溶液60mL/L，微量元素液25mL/L，維生素B11mg/L，初始pH4.5，發(fā)酵溫度37℃，接種量10%，非固定化培養(yǎng)5d。多糖產(chǎn)量從289.3mg/L提高到467.9mg/L。

黃孢原毛平革菌，多糖，響應(yīng)面，優(yōu)化

黃孢原毛平革菌（Phanerchaete chrysoprium）是白腐真菌的一種，具有發(fā)達(dá)的菌絲體。孢子表面有小桿狀結(jié)構(gòu)，表面組成為蛋白質(zhì)35%，糖20%，類烴物質(zhì)33%。采用發(fā)酵法生產(chǎn)真菌提取多糖具有周期短、成本低、產(chǎn)量大、易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，是一種大量獲得真菌多糖的有效途徑，對(duì)真菌多糖在生命科學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)的研究與開發(fā)有重要意義［1］。本研究試圖從黃孢原毛平革菌中提取胞外多糖，進(jìn)行多糖的組成性質(zhì)的研究，擴(kuò)展人們對(duì)微生物來源的多糖的認(rèn)識(shí)。響應(yīng)面分析（Response Surface Methodology）法系采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，將多因子實(shí)驗(yàn)中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似擬合，依此可對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系。它與過去廣為使用的“正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法”不同，具有實(shí)驗(yàn)周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)［2］。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)黃孢原毛平革菌多糖發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種 黃 孢 原 毛 平 革 菌（Phanerchaete chrysoprium）ATCC24725；麥芽汁斜面培養(yǎng)基 葡萄糖8g/L，麥芽汁10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，天冬氨酸1g/L，KH2PO42g/L，MgSO41g/L，維生素B11mg/L，瓊脂20g/L，NaOH調(diào)pH≥6.0；初始發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 10g/L，NH4Cl 0.2g/L，大量元素液［3］60mL/L，微量元素液［3］25mL/L，維生素B11mg/L；優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.4g/L，大量元素液60mL/L，微量元素液25mL/L，維生素B11mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子的制備 將孢子接種在上述固體培養(yǎng)基斜面上，30℃下培養(yǎng)5d，用無菌水把孢子洗出，4層紗布過濾。孢子濃度可由650nm下的吸光度來測定（當(dāng)吸光度為1.0時(shí)，孢子濃度大約是5×106個(gè)/mL）。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及效應(yīng)分析

1.2.2 培養(yǎng)方法 取發(fā)酵培養(yǎng)基100mL加入500mL錐形瓶中，121℃滅菌20min，孢子接種（每瓶接種量約3×107），置于37℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速140r/min。

1.2.3 多糖提取 將發(fā)酵所得的發(fā)酵液在熱水浴中浸提一段時(shí)間，期間不停進(jìn)行攪拌，使胞外糖析出，冷卻后過濾，收集發(fā)酵液備用，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行真空濃縮，加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀，盡量提高得率。選用真空冷凍干燥得到多糖。

1.2.4 分析方法 3，5-二硝基水楊酸法測還原糖［4］，苯酚-硫酸法測總糖［5］。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)［6-7］Plackett-Burman（PB）法是一種近飽和的2水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。它基于非完全平衡塊原理，能用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，以從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研究。

影響黃孢原毛平革菌多糖發(fā)酵的可能因素包括碳源、氮源濃度，pH、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、菌體形態(tài)等。為對(duì)這8個(gè)因素進(jìn)行全面考察，選用了N=11的PB設(shè)計(jì)，并余留3個(gè)空項(xiàng)作誤差分析［8］。每個(gè)因素取2個(gè)水平：低水平和高水平分別用“-”和“+”符號(hào)表示。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，各參數(shù)所代表因素及其水平見表2。

1.3.2 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)［9-11］響應(yīng)面分析法（response surface analysis）是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，其中最常用的是Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，本研究采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選到的關(guān)鍵因子進(jìn)一步研究，以獲得影響黃孢原毛平革菌發(fā)酵產(chǎn)多糖的優(yōu)化培養(yǎng)基。自變量按下式進(jìn)行編碼變換：

式中，Xi為自變量xi的編碼值，x0為自變量xi在中心點(diǎn)的值，△xi為自變量變化步長。用標(biāo)準(zhǔn)多項(xiàng)式回歸方程，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，便得到一個(gè)二次多項(xiàng)式，該方程為描述相應(yīng)量（應(yīng)變量）自變量關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。模型可描述為?/p>

式中，Y為預(yù)測響應(yīng)值，β0為截距，βi為線性系數(shù)，βii為平方系數(shù)，βij為交互作用系數(shù)。用 Design Expert程序?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，并對(duì)擬合方程作顯著性檢驗(yàn)及方差分析。所得擬合方程式（2）分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)數(shù)，得到方程

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)顯著因子的篩選

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)葡萄糖（A），酒石酸銨（B），培養(yǎng)轉(zhuǎn)速（D），培養(yǎng)時(shí)間（E），初始pH（G），培養(yǎng)溫度（H），接種量（J），菌體形態(tài)（K）8個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素選高低2個(gè)水平，以多糖的產(chǎn)量作為響應(yīng)值（Y）。另設(shè)3個(gè)虛擬列（C，F(xiàn)，I），以考察實(shí)驗(yàn)誤差。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析得出各因素的t值和可信度水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示（每組實(shí)驗(yàn)有3個(gè)重復(fù)，以平均值為準(zhǔn)），分別計(jì)算各因素效應(yīng)并進(jìn)行重要性評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。

由表2的分析結(jié)果可知，在黃孢原毛平革菌產(chǎn)多糖過程中，培養(yǎng)溫度、酒石酸銨和初始pH三個(gè)因素對(duì)多糖產(chǎn)量影響顯著，可信度在90%以上，可考慮作為主要因素進(jìn)一步做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)培養(yǎng)基

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù) Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定的實(shí)驗(yàn)因素和水平，采用 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)產(chǎn)多糖發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，以培養(yǎng)溫度X1（℃），酒石酸銨濃度X2（g/L）和初始pH X3為自變量，響應(yīng)值Y為多糖產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 三因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)結(jié)果

2.2.2 二次回歸擬合及方差分析 利用統(tǒng)計(jì)軟件MINITAB14.11對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合。多項(xiàng)式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2表達(dá)，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由T檢驗(yàn)確定。通過RSREG（響應(yīng)面回歸）過程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型，并進(jìn)而尋求最優(yōu)相應(yīng)因子水平，所得的分析結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果

圖1～圖3為響應(yīng)面分析的立體圖，從圖中可直觀地看出各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢，而且回歸模型確實(shí)存在最大值。求解方程組可以得出模型的極值點(diǎn)：X1=0.713，X2=-0.226，X3=0.174。相當(dāng)于培養(yǎng)溫度38.565℃，酒石酸銨0.4322g/L，初始pH 4.4631。

圖1 Y=f（X1，X2）響應(yīng)面

圖2 Y=f（X1，X3）響應(yīng)面

圖3 Y=f（X2，X3）響應(yīng)面

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳發(fā)酵條件和原始發(fā)酵條件分別進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)際產(chǎn)多糖量分別為467.9mg/L和289.3mg/L，可見該模型能較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明，Plackett-Burman設(shè)計(jì)與響應(yīng)面方法（RSM）相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法能快速、有效地從眾多影響黃孢原毛平革菌多糖產(chǎn)量液體發(fā)酵的因素中篩選出比較重要的影響因素并實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化，得到最佳操作條件，優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際發(fā)酵情況吻合較好。

經(jīng)上述方法優(yōu)化，黃孢原毛平革菌產(chǎn)多糖液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基為：葡萄糖10g/L，酒石酸銨0.4g/L，大量溶液60mL/L；微量元素液25mL/L；維生素B11mg/L；最佳發(fā)酵條件為pH4.5，發(fā)酵溫度37℃，接種量10%，非固定化培養(yǎng)5d。在此條件下，多糖產(chǎn)量從289.3mg/L提高到467.9mg/L。

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Optimization of fermentation conditions for polysaccharides of Phanerchaete chrysoprium based on response surface analysis

XU Yan-yan，ZHANG Zhao-hui*
（Department of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Two level factorials designs of Plackett-Burman were constructed to select the Phanerchaete chrysoprium fermentation medium components of polysaccharides.Experimental results showed that culture temperature，ammonium tartrate concentration and initial pH all had significant influence on the polysaccharides production，and the optimal conditions were as follows：glucose 10g/L，ammonium tartrate 0.4g/L，the volume of mass element solution 60mL/L，the quantity of trace element solution 25mL/L，VB11mg/L，initial pH4.5，culture temperature 37℃，inoculation quantity of 10%，nonimmobilized culture 5d.Under the optimal conditions，the polysaccharides production was increased from 289.3mg/L to 467.9mg/L.

Phanerchaete chrysoprium；polysaccharides；response surface method；optimization

TS201.2+3

A

1002-0306（2010）11-0221-04

2009-10-14 *通訊聯(lián)系人

許艷艷（1982-），女，碩士研究生，研究方向：生物工程。