應用萌發(fā)大豆生產益生菌發(fā)酵豆乳的研究

楊 媚，李 理

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

應用萌發(fā)大豆生產益生菌發(fā)酵豆乳的研究

楊 媚，李 理*

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

通過SDS-PAGE電泳分析大豆萌發(fā)過程中大豆蛋白亞基組成含量的變化，確定以萌發(fā)至2～3cm長的大豆作為主要原料，經瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合發(fā)酵制成發(fā)酵豆乳。研究表明，與非萌發(fā)大豆制成的發(fā)酵豆乳相比，以萌發(fā)大豆制成的發(fā)酵豆乳口感和質構均得到明顯改善，硬度和脆度分別下降了38.61%和38.85%，粘附性從-86.779g·s增加至-52.172g·s，口感更細膩柔軟粘稠，與發(fā)酵純牛乳相接近。

大豆萌發(fā)，大豆酸乳，發(fā)酵純牛乳，蛋白亞基，質構特性

大豆作為世界上最重要的油料作物之一，富含蛋白質（將近40%）、不飽和脂肪酸、卵磷脂和異黃酮等營養(yǎng)物質［1］，近年來已被用于部分替代牛乳生產類酸奶產品［2］。然而，發(fā)酵豆乳存在豆腥味、青草味等不良風味［3］，具有產酸不足、口感不夠細膩爽滑、質構粗糙硬脆不夠柔軟粘稠等問題，因此并未被普遍接受。大量研究表明，萌發(fā)大豆去除了抗營養(yǎng)因子［4］和引起豆腥味的脂肪氧化酶［5］，而增加了膳食纖維、維生素和活性異黃酮［6］等營養(yǎng)物質，且能產生豐富的內源蛋白酶，對大豆蛋白亞基進行一定程度的降解［7］。而大豆蛋白質結構亞基組成的改變，可以影響大豆蛋白的凝膠網絡結構［8］，進而影響發(fā)酵豆乳的質構特性。國內外對發(fā)酵豆乳的研究大多通過工藝的改進來改善口感風味，但應用萌發(fā)大豆內源蛋白酶降解大豆蛋白以改善發(fā)酵豆乳的質構特性尚未見報道。本文以萌發(fā)大豆作為主要原料制作發(fā)酵豆乳，與未萌發(fā)大豆發(fā)酵酸乳對比，質構特性及口感風味均有顯著改善，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 市售；脫脂乳粉 蛋白質含量36.4%，新西蘭產；精制蔗糖、NaOH等 均為分析純；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus AS1.1482，簡寫為L.B 1482） 購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus IFFI 6038，簡寫為S.T 6038） 購于廣東省微生物研究所菌種保藏中心；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus LH-B02，簡寫為LH-B02） Hansen樣品。

JJ500型電子天平 浙江余姚銘稱重校驗設備有限公司；ECP3000三恒電泳儀 北京六一儀器廠；雙板夾芯式垂直槽（DYCZ-30型） 廣州市叢源儀器有限公司；Seven Easy pH計（S20） 瑞士；YXQSG46-280S型手提式高壓滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設備有限公司；PXY-190S-A型生化培養(yǎng)箱 廣東韶關科力儀器有限公司；HSG-IB-2型電熱恒溫水浴鍋常州奧華儀器有限公司；HR 1727 PHILIPS攪拌機珠海飛利浦家用電器有限公司；TA XT2i/25質構儀 英國SMS公司；SZX超凈工作臺 吳江凈化設備總廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆籽粒萌發(fā) 選擇籽粒飽滿均一、無蟲蛀霉變的完整大豆籽粒，沖洗去雜后于30℃浸泡12h，在培養(yǎng)盆中以雙層紗布鋪蓋萌發(fā)，30℃分別萌發(fā)至胚芽長度為0（30℃浸泡12h）、0.5、1、2、3、4、5、6、7cm。

1.2.2 SDS-PAGE分析大豆萌發(fā)過程中蛋白質亞基組分含量的變化 參照LaemmLi［9］的電泳方法。將萌發(fā)至一定長度的豆芽洗凈去皮，以1∶12（w/v）豆水比打漿過濾，濾液經稀釋處理后得到濃度為2.23g/mL的待測樣品，于沸水中加熱5min后，以10000r/min離心5min。上樣量為10μL，分離膠、濃縮膠濃度分別為12.5%和3%，濃縮膠電流為40mA，分離膠電流為80mA。電泳完畢后凝膠以考馬斯亮藍R250染色40min，過夜脫色至透明后拍照。

1.2.3 發(fā)酵純牛乳及發(fā)酵豆乳的制作

1.2.3.1 發(fā)酵豆乳制作工藝流程 大豆→挑選、浸泡→萌發(fā)→去皮→熱磨漿→過濾→豆乳→加糖、牛乳→滅菌→42℃發(fā)酵4h→4℃冰箱中冷藏

1.2.3.2 發(fā)酵豆乳及復原乳的準備 取未萌發(fā)（30℃浸泡12h，即0cm）和萌發(fā)至一定長度的大豆，去皮，用85℃熱水磨漿（豆水比為1∶10），過180目篩后制成豆?jié){備用。配制12%脫脂乳粉復原牛乳，豆?jié){和牛乳的比例為7∶3，制成未萌發(fā)和萌發(fā)大豆發(fā)酵豆乳，添加8%的蔗糖，100℃滅菌20min。

配制12%脫脂乳粉復原牛乳，添加8%的蔗糖，100℃滅菌20min。

1.2.3.3 母發(fā)酵劑、工作發(fā)酵劑的制備 配制12%的牛乳，經115℃滅菌10min后，在復原牛乳中分別接入瑞士乳桿菌LH-B02、保加利亞乳桿菌L.B 1482和嗜熱鏈球菌S.T 6038，42℃靜止培養(yǎng)24h為母發(fā)酵劑，在牛乳中接入10%的母發(fā)酵劑，42℃靜止培養(yǎng)24h為工作發(fā)酵劑。

工作發(fā)酵劑活化數次后，參照劉占祥［10］等人的方法測定菌種活力，活力達到0.7時即可接種。

1.2.3.4 接種 分別添加2%的瑞士干酪乳桿菌（Lactobacillus helveticus LH-B02），1.5%的保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus AS1.1482）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus IFFI6038），每種處理做3個平行，混勻后42℃靜止培養(yǎng)4h后取出，4℃后熟24h。

1.2.4 發(fā)酵豆乳和發(fā)酵純牛乳各項指標的測定

1.2.4.1 pH的測定 用Seven Easy pH計（S20）測定樣品的pH。

1.2.4.2 酸度的測定 以涅爾度°T為酸度測定指標，按GB/T 5009.46-2003《乳與乳制品衛(wèi)生標準的分析方法》測定。

1.2.4.3 質構的測定 本實驗具體的TPA測試參數為：T.P.A測定模式，預壓速度1.0mm/s，測定時探頭速度1.0mm/s，壓后速度1.0mm/s，下壓比例30%，探頭型號SMSP/0.5，數據獲取速度200pps，溫度為室溫，樣品厚度5cm。

1.2.4.4 感官描述 分別對發(fā)酵制品的色澤、組織狀態(tài)、口感和滋味等進行描述分析。

1.2.4.5 數據處理與分析 實驗數據采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，進行一維方差分析。平均值和標準偏差由三個樣品的測量結果經計算得到。

2 結果與討論

2.1 大豆萌發(fā)過程中蛋白亞基組成含量的變化

從圖1可知，大豆在整個萌發(fā)過程中，11S球蛋白的堿性亞基B（B3，B1a，B1b，B2，B4）電泳譜帶并沒有發(fā)生明顯變化。而11S酸性亞基A3、A（A1a，A1b，A2，A4）及7S球蛋白的α′、α、β亞基在大豆萌發(fā)至2cm長時，電泳帶開始變淡和模糊，在3cm時電泳帶變深，但從4cm開始隨著豆芽長度的增加而逐漸變淡。其中，豆芽長至4cm和7cm長時，A3亞基和α′、α亞基的電泳帶均已基本消失。

圖1 大豆種子萌發(fā)過程中蛋白亞基組成SDS-PAGE圖譜

大豆在萌發(fā)過程中產生的內源蛋白酶能夠降解儲藏蛋白，為豆芽及幼苗的生長提供物質基礎。焉華娟等人［7］研究發(fā)現，大豆萌發(fā)至48h（2cm）時，內源蛋白酶活力出現峰值，具有較高的酶活性，稍有下降后維持在穩(wěn)定水平?？梢?，大豆萌發(fā)至2cm時，11S球蛋白酸性亞基A3、A及7S球蛋白的α′、α、β亞基開始被內源蛋白酶降解，而長至3cm時，由于蛋白酶活性稍有下降，且部分蛋白質可能被重新合成，所以亞基組成含量有所回升。

大豆在萌發(fā)到2cm至3cm時，大分子的儲藏蛋白亞基開始出現一定程度的降解，但又未被過多地降解，較符合下一步的實驗要求，因而選擇2～3cm長的豆芽作為原料，用于制作萌發(fā)大豆發(fā)酵豆乳。

2.2 發(fā)酵純牛乳及發(fā)酵豆乳的pH及酸度的分析比較

表1所示，0cm和2～3cm發(fā)酵豆乳的pH均可達到4.0以下，而發(fā)酵純牛乳的pH則為4.19±0.010，表明LH-B02、L.B 1482及S.T 6038混合發(fā)酵劑能夠更好地利用牛乳和豆乳中的蛋白質成分進行發(fā)酵，產生更多的游離H離子，因而發(fā)酵豆乳的pH更低。

酸度是評價酸奶品質的一項重要指標，發(fā)酵豆乳的酸度均能達到85°T以上，符合《GB19302-2003酸乳衛(wèi)生標準》中發(fā)酵純牛乳的酸度要求（≥70°T）。而發(fā)酵純牛乳的酸度更是高達105.97±0.912°T，可見加入瑞士乳桿菌能提高發(fā)酵豆乳的酸度值，且其在牛乳中也有很強的產酸能力［11］。

表2 發(fā)酵純牛乳和發(fā)酵豆乳質構特性的比較

統(tǒng)計學分析發(fā)現，0cm和2～3cm發(fā)酵豆乳的pH及酸度值并無顯著性差異（p＞0.05），可見大豆萌發(fā)至2～3cm時，其11S球蛋白酸性亞基A3、A及7S球蛋白的α′、α、β亞基的降解，并不會對組合發(fā)酵菌種的生長情況及產酸能力產生太大的影響。

2.3 質構特性的分析比較

T.P.A（Texture Profile Analysis）通過模擬人口腔的咀嚼運動，對樣品進行兩次壓縮［12］，質構分析儀經微機將質構測試曲線輸出，得出各項質構特性參數，各發(fā)酵制品的質構測定結果如表2所示。

研究顯示，除彈性略有下降外，2～3cm發(fā)酵豆乳的質構參數均與發(fā)酵純牛乳相近，且硬度和脆度及膠性均比0cm發(fā)酵豆乳低（P＜0.01），而粘附性及凝聚性則有增加（P＜0.01）。

硬度（Hardness）是第一次壓縮樣品時產生的最大峰值，大多出現在最大變性處［12］，模擬牙齒壓縮樣品需要的力。脆度（Fracturability）是第一次壓縮過程中樣品出現破裂現象時的峰值［13］，模擬牙齒咬樣品直至樣品破裂所用的力。粘附性（Adhesiveness）模擬人口腔舌頭離開樣品所用的力［12］。大豆經過萌發(fā)后，發(fā)酵豆乳的硬度和脆度分別下降了38.61%和38.85%，粘附性從-86.779±12.017g·s增加至-52.172±12.312g·s，口感更為粘稠，與發(fā)酵純牛乳十分相近。發(fā)酵純牛乳的凝膠結構是由一些裸露的、大小不同的球形酪蛋白分子堆積而成酪蛋白粒子網絡結構，有游離末端的暴露，幾乎沒有形成鏈狀結構［14］，因而具有較低的硬度、脆度。大豆球蛋白是分子量為300～380kDa的六聚體，每個亞基均由一條酸性和堿性多肽鏈組成，通過二硫鍵進行結合，且各個亞基上還分別含有2～3個胱氨酸和半胱氨酸側鏈殘基［8］，因而整個分子顯得較致密，分子剛性較強，凝膠結構較堅硬而質脆［15］。Utzumi等人發(fā)現在形成大豆蛋白凝膠過程中，11S球蛋白的堿性多肽鏈可與7S的β亞基相互作用形成可溶性聚集體［16］。大豆在萌發(fā)過程中，部分降解的7Sβ亞基使大豆蛋白凝膠中可溶性聚集體形成減少；而豆芽中產生的內肽酶能夠降解大豆蛋白質為長短不一的大豆多肽片段［7］，分子結構變得疏松，使萌發(fā)大豆制成的發(fā)酵酸乳凝膠三維網絡結構交聯度下降，分枝減少［17］。其交聯網絡結構中的羧基、羥基、羰基等親水基團更多地暴露出來，更多的水分進入大豆蛋白凝膠復合體系中［18］，使萌發(fā)大豆發(fā)酵豆乳的凝膠三維網絡結構更為疏松，脆性下降，粘附性增加，更接近發(fā)酵純牛乳疏松的凝膠結構，口感表現為更細膩柔軟粘稠。

膠性（Gumminess）用于描述半固體樣品的黏性特性，其模擬評估食品解聚前需要用舌頭對上顎進行操作的次數［19］。實驗表明，萌發(fā)使發(fā)酵豆乳的膠性下降，更為接近發(fā)酵純牛乳的黏性口感。凝聚性（Cohesiveness）用于評估口腔咀嚼時樣品破裂前變形所需的力［13］，其取決于樣品結構內部結合的強度［19］。經統(tǒng)計學分析，2～3cm發(fā)酵豆乳的凝聚性更高（P＜0.01），更接近發(fā)酵純牛乳的凝聚性，表明發(fā)芽大豆發(fā)酵豆乳樣品內部結合強度較 0cm的大。彈性（Springiness）模擬口腔壓縮樣品，移去壓力后樣品的恢復度和時間有關，停隔的時間越長，恢復的高度越大［19］。與發(fā)酵純牛乳不同，發(fā)酵豆乳主要由分子結構緊密的大豆蛋白質發(fā)酵而成，因而彈性稍有下降。

2.4 感官描述比較分析

與未萌發(fā)大豆（0cm）相比，萌發(fā)大豆（2～3cm）的發(fā)酵豆乳制品顏色稍白些，更接近發(fā)酵純牛乳乳白色的色澤。從組織狀態(tài)而言，發(fā)酵純牛乳、發(fā)酵豆乳的凝乳結構都比較均勻，表面光滑無氣泡和裂縫；牛乳中含有較多乳清蛋白，因而發(fā)酵純牛乳有少量乳清析出，而發(fā)酵豆乳均無乳清析出。與發(fā)酵純牛乳相比，0cm發(fā)酵豆乳質地稍硬些，入口時有顆粒感，而2～3cm發(fā)酵豆乳凝乳結構更為細膩、質地更柔軟粘稠，入口無明顯顆粒感，更接近發(fā)酵純牛乳的口感。這是由于豆芽中的內源蛋白酶水解大豆蛋白質為大豆多肽，因而利于形成更為細膩、柔軟的凝乳三維網絡結構。

大豆的豆腥味是由大豆脂肪氧化酶（Lipoxygenase）催化亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸酶促反應生成醛、酮等異味物質而導致的［20］。大豆萌發(fā)后，發(fā)酵豆乳已無明顯豆腥味和豆味，這可能是由于經降解產生的大豆多肽能與底物競爭酶的活性部位，抑制了脂肪氧化酶的活性［21］，導致脂肪氧化酶活性降低了43%［5］，進而消除了萌發(fā)大豆發(fā)酵豆乳的豆腥味和豆味。

表3 發(fā)酵純牛乳和發(fā)酵豆乳的感官描述比較

3 結論

3.1 經SDS-PAGE分析萌發(fā)過程中大豆蛋白質亞基組成的變化情況，發(fā)現大豆在萌發(fā)至2～3cm時，11S球蛋白酸性亞基A3、A（A1a，A1b，A2，A4）及7S球蛋白α′、α、β亞基開始被降解，且隨著芽長的增加，降解程度增加。

3.2 萌發(fā)至2～3cm的大豆所制成的發(fā)酵豆乳，色澤呈均一的微黃色，組織細膩均一、具發(fā)酵豆乳固有的乳香味和豆香味，無明顯豆腥味和豆味，口感爽滑。在42℃經組合益生菌發(fā)酵劑培養(yǎng)4h后，pH低至4.0，酸度達85°T以上，酸甜適中。硬度和脆度分別比未萌發(fā)大豆發(fā)酵制品下降了38.61%和38.85%，粘附性從-86.779g·s增加至-52.172g·s，質構特性與發(fā)酵純牛乳的十分接近，遠優(yōu)于非萌發(fā)大豆發(fā)酵豆乳制品。

［1］Smish AK，Huyser W.World distribution and significance of soybean//Soybeans：Improvement，Production，and Uses［M］. Madison，USA：American Society of Agronomy Inc，1987：1-22.

［2］Fang TJ，Yang CYS.Effects of yogurts partially replaced by soymilk on growth kinetics oflactic acid bacteria，acid production，and the sensory properties of final products［J］.Food Sci，1992，19：253-263.

［3］Lee SY，Morr CV，Seo A.Comparison of milk-based and soymilk-based yogurt［J］.J Food Sci，1990，55（2）：532-536.

［4］張繼浪，駱承庠.大豆在發(fā)芽過程中的化學成分和營養(yǎng)價值變化［J］.中國乳品工業(yè)，1994，22（2）：68-75.

［5］蔣和體，佐藤匡央.大豆脂肪氧化酶酶活性變化研究［J］.中國糧油學報，2006，21（3）：133-135.

［6］Feng SB，Saw CL，Lee YK，et al.Novel Process of Fermenting Black Soybean ［Glycine max（L.）Merrill］ Yogurt with Dramatically Reduced Flatulence-Causing Oligosaccharides but Enriched Soy Phytoalexins［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（21）：10078-10084.

［7］焉華娟，郭順堂.大豆發(fā)芽過程中蛋白質水解作用研究［J］.食品科技，2007（10）：40-44.

［8］Utsumi S，Matsumura Y，Mori T.Structure-Function Relationships of Soy Proteins［M］.New York：Marcel Dekker，1997：257-291.

［9］LaemmLi Uk.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227：680-685.

［10］劉占祥，王琪，沈晶.酸牛奶的加工技術［J］.寧夏農林科技，2000（5）：62-63.

［11］王振強，申森.利用瑞士乳桿菌制作酸奶的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（6）：91-94.

［12］Szczesniak AS.Classification of textural characteristics［J］. Food Sci，1963，28：385-389.

［13］Bourne MC.Texture profile analysis［J］.Food Technol，1978，32（7）：62.

［14］Fiszman SM，Liuch MA，Salvador A.Effect of Addition of Gelatin on Microstructure of Acidic Milk Gels and Yoghurt and on Their Rheological Properties［J］.International Dairy Journal，1999，9：899-900.

［15］王洪晶，華欲飛.大豆分離蛋白凝膠研究進展［J］.糧食與油脂，2005（2）：3-5.

［16］Utzumi S，Damodaran S，Kinsella JE.Heat-Induced Interaction between Soybean Proteins：Preferential Association of 11S Basic Subunits and β-Subunits of 7S［J］.J Agric Food Chem，1984，32：1406-1412.

［17］李榮華.乳蛋白對凝固性酸奶流變學特性及微觀結構的影響［D］.東北農業(yè)大學，2007.

［18］李鋒，華欲飛.大豆酸奶的微結構以及分型特征［J］.食品科學，2005，26（7）：110-115.

［19］吳洪華，姜松.食品質地及其TPA測試［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26（5）：128-132.

［20］Andre E，Hou KW.The presence of a lipoxidase in soybean［J］.Glycine Soya Lieb CR Acad Sci，1932，194：645-647.

［21］曹平.天然抗氧化劑抑制油脂氧化的研究進展［J］.中國油脂，2005（7）：49-53.

Study on the production of probiotics fermented soy yogurt by germinated soybean

YANG Mei，LI Li*
（College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The changes of soybean protein subunit content during soybean germination were studied by using SDS-PAGE.2cm to 3cm long germinated soybeans were fermented by Lactobacillus helveticus LH-B02，Streptococcus thermophilus lFFl 6038 and Lactobacillus bulgaricus AS1.1482 as the main materials.The result indicated that hardness and fracturability were decreased by 38.61%and 38.85%respectively，compared with un-germinated soymilk yogurt.Meanwhile，adhesiveness was increased from-86.779g·s to-52.172g·s.The taste，flavor and texture properties of the germinated soymilk yogurt were evidently improved and similar to yogurt.

soybean germination；soy yogurt；fermented milk；protein subunits；texture properties

TS214.2

A

1002-0306（2010）11-0206-04

2009-10-19 *通訊聯系人

楊媚（1986-），女，在讀碩士生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。