枯草芽孢桿蔚BS-05產(chǎn)纖維素酶條件的研究

涂宗財,江國忠,劉益東,劉成梅,張秋婷

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)

枯草芽孢桿蔚BS-05產(chǎn)纖維素酶條件的研究

涂宗財,江國忠,劉益東,劉成梅,張秋婷

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)

以實驗室篩選的枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶菌株BS-05為出發(fā)菌株,對其產(chǎn)纖維素酶條件進(jìn)行了研究。實驗結(jié)果表明,菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶的最佳條件是:以2%的CMC-Na為碳源,2%的蛋白胨和2%的酵母粉為氮源,產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始 pH為7,裝液量為 60mL/250mL,接種量 5%,在37℃,150r/min下培養(yǎng)48h。在此條件下,該菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng),羧甲基纖維素酶活力CMCA達(dá) 195.46U/mL,濾紙酶活力 FPA達(dá) 174.52U/mL。

枯草芽孢桿菌,纖維素酶,產(chǎn)酶條件,優(yōu)化

枯草芽孢桿菌 (B acillus subtilis)為革蘭氏陽性細(xì)菌,嗜溫、好氧,生理特征豐富多樣,分布廣泛,極易分離培養(yǎng)[1],可產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶和木聚糖酶[2]等十多種酶,且發(fā)酵周期短,應(yīng)用前景廣闊。纖維素是自然界中存在最廣泛的一類碳水化合物,也是地球上最豐富的再生資源,約占生物總量的50%。但由于組成結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,其轉(zhuǎn)化利用一直是個難題[3]。絕大多數(shù)纖維素未被利用,若將其轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食物和化工原料,將對緩解人類社會環(huán)境污染、食物短缺和能源危機(jī)有重大意義[4],而利用微生物產(chǎn)纖維素酶的降解作用,是纖維素資源開發(fā)利用的有效途徑之一。產(chǎn)纖維素酶的微生物廣泛分布于真菌、細(xì)菌、放線菌等菌屬中,目前的研究基本集中在真菌方面,主要有木霉屬、曲霉屬和青霉屬等[5-7],但是都不同程度地存在著酶活力不高、生產(chǎn)周期過長等問題。因此,對繁殖快、周期短、產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)酶研究,具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應(yīng)用前景。本文即以一株實驗室前期篩選的產(chǎn)纖維素酶的枯草芽孢桿菌 BS-05為出發(fā)菌株,研究其產(chǎn)酶的最佳條件,為該菌的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用及纖維素的有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用菌種 實驗室前期篩選到的一株產(chǎn)纖維素酶的枯草芽孢桿菌 BS-05;保藏培養(yǎng)基 牛肉膏0.5%,蛋白胨 1%,氯化鈉 0.5%,瓊脂 2%,蒸餾水, pH7.2～7.4;篩選培養(yǎng)基 CMC-Na 1%,蛋白胨 1%,酵母粉 1%,NaCl 0.5%,KH2PO40.02%,MgSO40.02%,瓊脂 2%,蒸餾水,pH7.2～7.4;種子培養(yǎng)基保藏培養(yǎng)基不加瓊脂;產(chǎn)酶培養(yǎng)基 碳源,氮源, NaCl 0.5%,K2HPO40.02%,MgSO40.02%,pH待定。

LDZX40B I高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠; T6新世紀(jì)紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司; PYX-150H-B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東韶關(guān)科力實驗儀器有限公司;THZ-82(A)數(shù)顯水浴恒溫振蕩器江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;T DL-5-A離心機(jī) 上海飛鴿系列離心機(jī)廠;其它常規(guī)玻璃儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)及粗酶液的制備 將菌株 BS-05從保藏斜面接種于篩選培養(yǎng)基平板,恒溫培養(yǎng)箱中37℃活化 24h后,接種于裝有 40mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,水浴搖床中 37℃、150r/min培養(yǎng)12～24h,生成種子液。再按一定接種量將種子液接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,并按一定條件培養(yǎng)產(chǎn)酶。培養(yǎng)液4800r/min離心 15min,取上清液,即為粗酶液。

1.2.2 纖維素酶活力的測定[8]參見文獻(xiàn)[8]。

1.2.3 液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件的研究 對影響菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶的多個影響因素進(jìn)行單因素實驗,再正交優(yōu)化,獲得菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳碳源、氮源的選擇與確定

以 2%的蛋白胨為氮源,再分別以 1%的CMC-Na、葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、豆渣、稻草桿屑、甘蔗渣和米糠為受試碳源,按 2%的接種量將液體種子接種于裝有 40mL營養(yǎng)液的 250mL的三角瓶中,通氣塞封口,搖床內(nèi) 37℃、150r/min培養(yǎng) 36h,提取粗酶液并測定其羧甲基纖維素酶活力 CMCA及濾紙酶活力 FPA,實驗結(jié)果如圖 1。由圖可知,以CMC-Na為碳源時,菌株 BS-05產(chǎn)纖維素酶活力CMCA與 FPA都取得最高值。

圖 1 碳源的選擇

以最佳碳源CMC-Na為碳源,質(zhì)量濃度為 1%,再分別以 2%的蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、KNO3, NH4Cl,NH4NO3、尿素和豆渣為受試氮源,按碳源選擇實驗同樣參數(shù)培養(yǎng)產(chǎn)酶,結(jié)果見圖 2。

圖 2 氮源的選擇

由圖 2可知,以蛋白胨與酵母粉為氮源時,菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶活力最高,但 CMCA與 FPA分別在以蛋白胨和酵母粉為氮源時達(dá)最高值。為使所產(chǎn)纖維素酶系中組分均衡,選擇蛋白胨與酵母粉的等量混合物為最佳氮源。值得注意的是,菌株 BS-05產(chǎn)纖維素酶的最佳碳源和最佳氮源與篩選獲得該菌株所用的碳源和氮源相同,這可能是由于纖維素酶是誘導(dǎo)酶[9],而枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶一定程度上可能也具有誘導(dǎo)性。

2.2 碳源與氮源比例的確定

確定最佳碳源與氮源后,改變二者在培養(yǎng)基中的比例,按碳源選擇實驗同樣參數(shù)培養(yǎng)產(chǎn)酶,結(jié)果見圖3。

圖 3 碳源與氮源用量比的確定

結(jié)果表明,培養(yǎng)基中 C/N對菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶有一定的影響。纖維素酶活力CMCA與 FPA均總體上隨 C/N的減小而上升,達(dá)峰值后有所下降,并在C/N為2%/4%時,CMCA及總酶活力(CMCA與FPA之和)最大,因此,C/N應(yīng)為 2%/4%。

2.3 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

其它條件相同,設(shè)定不同接種量,考察其對菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶的影響,結(jié)果如圖 4。

圖 4 接種量對產(chǎn)酶的影響

由圖 4可知,菌株 BS-05產(chǎn)纖維素酶活力CMCA與 FPA分別在接種量為 5%和 4%時最高,并分別在 3%～5%和 3%～4%間基本穩(wěn)定?？紤]總酶活力,接種量應(yīng)為4%。

2.4 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

其它條件相同,設(shè)定不同的培養(yǎng)溫度,考察溫度對菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶的影響,結(jié)果如圖 5所示。

圖 5 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

由圖可知,菌株 BS-05產(chǎn)纖維素酶受培養(yǎng)溫度的影響較大。酶活力 CMCA與 FPA均在 37℃時最高,其它溫度下,該菌株均不能正常代謝產(chǎn)酶,酶活力都較低。

2.5 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶的影響

其它條件相同,設(shè)定不同的培養(yǎng)時間,考察其對菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶的影響,結(jié)果如圖 6所示。

圖 6 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

由圖可知,菌株 BS-05所產(chǎn)纖維素酶活力CMCA與 FPA均在 48h達(dá)最大值,之后隨時間的延長略有降低。

2.6 初始 pH對菌株產(chǎn)酶的影響

其它條件相同,設(shè)定不同的培養(yǎng)基初始 pH,考察其對菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶的影響,結(jié)果如圖 7所示。

圖 7 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響

結(jié)果顯示,培養(yǎng)基初始pH對菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶影響較大,酶活力 CMCA與 FPA分別在 pH7和pH6時獲得最大值。而 pH7時 CMCA與總酶活力均較 pH6時高,因此,最適培養(yǎng)基初始 pH應(yīng)為 7。

2.7 裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響

其它條件相同,設(shè)定不同的培養(yǎng)基裝液量,考察其對枯草芽孢桿菌 BS-05產(chǎn)纖維素酶的影響,結(jié)果如圖8。

圖 8 裝液量對產(chǎn)酶的影響

由圖可知,裝液量在一定范圍內(nèi)對該菌株產(chǎn)纖維素酶影響不大,但 CMCA與 FPA分別在裝液量超過60mL與 70mL后逐漸降低。原因可能是裝液量增多,單位體積培養(yǎng)液中的溶氧量隨之下降,影響了菌株BS-05的好氧發(fā)酵和產(chǎn)酶,因此裝液量以 60mL為宜。

2.8 產(chǎn)酶條件的正交優(yōu)化

為研究枯草芽孢桿菌BS-05產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件,設(shè)計正交實驗對各影響因素綜合考察。由于培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基初始 pH對菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶影響較大,因此,優(yōu)化實驗在確定培養(yǎng)溫度為37℃、培養(yǎng)基初始 pH為 7的前提下,針對接種量、培養(yǎng)時間和裝液量進(jìn)行。因素水平表見表 1,正交實驗結(jié)果與分析見表 2～表 4。

表 1 正交實驗因素水平表

表 2 正交實驗結(jié)果

表 3 實驗結(jié)果直觀分析表

表 4 實驗結(jié)果方差分析表

實驗結(jié)果表明,菌株產(chǎn)酶活力 CMCA與 FPA的因素影響均為B>A>C,即培養(yǎng)時間影響最大,接著依次為接種量與裝液量。不同的是,CMCA的優(yōu)化條件為 A3B2C2,而 FPA為 A2B2C2,即接種量影響菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶系的組分。分別按 4%與 5%的量接種培養(yǎng),結(jié)果顯示,接種量為 5%時,CMCA與 FPA分別為 195.46U/mL和 174.52U/mL,較接種量為 4%時的CMCA與總活力更高。因此,菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度 37℃、培養(yǎng)基初始 pH7、接種量 5%、培養(yǎng)時間 48h、裝液量 60mL,在此條件下,枯草芽孢桿菌 BS-05產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng),酶活力最高,CMCA與 FPA分別達(dá) 195.46U/mL和174.52U/mL。

3 結(jié)論

通過對枯草芽孢桿菌BS-05產(chǎn)纖維素酶的營養(yǎng)條件與培養(yǎng)條件進(jìn)行研究,結(jié)果表明,不同的碳源、氮源及 C/N比和溫度、時間、接種量、裝液量及培養(yǎng)基初始 pH等因素均對該菌株產(chǎn)纖維素有一定的影響。菌株BS-05產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件為:以 2% CMC-Na為碳源,2%蛋白胨與 2%酵母粉為氮源,培養(yǎng)基初始 pH7,裝液量 60mL/250mL,接種量 5%, 37℃,150r/min條件下培養(yǎng) 48h,該菌株產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng),酶活力最高,CMCA與 FPA分別達(dá)195.46U/mL和 174.52U/mL。

與其它學(xué)者關(guān)于枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶的研究相比,枯草芽孢桿菌 BS-05所產(chǎn)纖維素酶活力CMCA與之相當(dāng)[10]或稍低[11],但其 FPA與 CMCA值相近,表明所產(chǎn)纖維素酶系中 C1酶組分與 Cx酶組分較均衡,具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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Study on the cellulase producing conditions of the Bacillus subtilis BS-05

TU Zong-ca i,JI ANG Guo-zhong,L IU Y i-dong,L IU Cheng-mei,ZHANG Qiu-ti ng
(State KeyLaboratory of Food Science and Technology,NanchangUniversity,Nanchang 330047,China)

Labora tory sc reening ce llulase p roduc ing bac te ria l s tra in BS-05was the p urp ose bac te ria l s tra in,the bes t cond itions for its p roduc tion of ce llulase was s tud ied.The exp e ri m ent results we re:2%CMC-Na as the ca rbon source,2%p ep tone and2%dus ty yeas t as the nitrogen source,the initia l fe rm enta tion m ed ium pH was ad jus ted to7,liquid volum e was60mL/250mL,inoculum s ize was5%,37℃,cultiva ted48h a t150r/m in.Unde r these cond itions,its enzym e p roduc ing ab ility was the s tronges t,in the c rude extrac t,ce llulose enzym e ac tivity was the highes t,ca rboxy m e thyl ce llulase CMCA ac tivity reached to195.46U/mL,filte r p ap e r enzym e ac tivity FPA reached to174.52U/mL.

Bac illus sub tilis;ce llulose;enzym e p roduc ing cond ition;op ti m iza tion

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)05-0181-04

2009-10-28

涂宗財(1965-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:食品資源的開發(fā)利用。

教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃項目(I RT0540)。