仙山人掌凍干粉提取工藝優(yōu)化和抗敏功效檢測(cè)

趙 華,邳 楠,何聰芬,王海濤,李 偉,董銀卯

(北京工商大學(xué),北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100037)

仙山人掌凍干粉提取工藝優(yōu)化和抗敏功效檢測(cè)

趙 華,邳 楠,何聰芬,王海濤,李 偉,董銀卯＊

(北京工商大學(xué),北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100037)

[目的]研究仙人掌凍干粉提取工藝和抗敏效果,為其在功能食品中的開(kāi)發(fā)利用提供部分參考。[方法 ]選用酶解法提取仙人掌的活性成分,采用透明質(zhì)酸酶體外抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定其抗過(guò)敏功效,對(duì)仙人掌凍干粉的纖維素酶解提取物和 22種中藥提取物的抗敏效果進(jìn)行了對(duì)比。[結(jié)果]仙人掌凍干粉最終的提取工藝流程:所采用的酶為纖維素酶,提取的工藝條件為:溫度50℃,pH為5,添加量為0.15u/mL,固液比為1∶20,纖維素酶解時(shí)間為1h。仙人掌酶解水提取物的抗敏效果最好。[結(jié)論]仙人掌凍干粉的水提物具有優(yōu)異的抗敏功效。

仙人掌凍干粉,酶提法,工藝優(yōu)化,抗敏功效

過(guò)敏是機(jī)體受抗原性物質(zhì)刺激后引起的組織損傷或生理紊亂。目前過(guò)敏人群已占全世界人口的40%,如在美國(guó) 20%以上的人都受過(guò)過(guò)敏疾病的困擾。從天然的植物中提取出活性成分,具有低毒高效的作用效果,越來(lái)越受到人們的青睞,可作為新型的食品添加劑,用于保健食品的研究開(kāi)發(fā)[1-2]。仙人掌(cactus)為仙人掌科仙人掌屬植物,主要分布于南美洲、非洲、東南亞、南亞和我國(guó)南方等熱帶、亞熱帶地區(qū),云南省境內(nèi)具有豐富的資源分布。仙人掌中含有 SOD、多糖、生物堿、黃酮甙、皂甙等成分,具有抑菌、消炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、降血糖、抗脂質(zhì)過(guò)氧化等藥理作用,并有多種臨床用途[3-6]。但是,迄今為止,國(guó)內(nèi)外關(guān)于仙人掌的抗敏抗刺激作用方面的文獻(xiàn)很少,尤其是關(guān)于仙人掌粉提取物添加到抗敏食品中的研究。本文以仙人掌粉為原料,采用酶轉(zhuǎn)化法作為前處理手段,并對(duì)仙人掌粉提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,提高有效成分的提取率并對(duì)其抗敏功效進(jìn)行檢測(cè),為其應(yīng)用于抗敏食品中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

扭刺仙人掌粉 昕圣生物科技發(fā)展有限公司,其中粗蛋白含量為 0.65%～0.68%,脂肪含量為 0.30%～0.31%;酶制劑 均為天津諾維信酶制劑公司,具體性質(zhì)見(jiàn)表 1;其余試劑 均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑。

表 1 實(shí)驗(yàn)用酶制劑的性質(zhì)

pH計(jì)、電導(dǎo)率儀 上海天達(dá)儀器有限公司; 2WAJ阿貝折光儀 上海光學(xué)儀器廠;HH·S1-M電熱恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;UV-2300紫外光譜分析儀 上海天美科學(xué)儀器;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解法提取仙人掌凍干粉的工藝流程 仙人掌凍干粉→預(yù)處理→調(diào)節(jié)溫度和 pH→加酶→酶解→滅酶→除渣→脫色→離心→旋蒸→高溫滅菌→防腐

按料液比 1∶20(50g∶1000mL)配料[10],以 E/S為0.15u/mL添加酶[11],調(diào)節(jié)適宜的 pH和溫度,水浴提取一定時(shí)間后,于 80℃高溫滅酶 10min,再靜置 2h除渣。添加 1%活性炭 70℃下脫色 1h,5000r/min離心15min后,取上清液,在壓力 0.08MPa、溫度 70℃下旋蒸至原體積的 1/5。90℃下滅菌 30min,加入 0.6% LGP防腐劑,得到仙人掌凍干粉提取液。

1.2.2 不同種類(lèi)的酶對(duì)仙人掌粉有效成分含量的影響 分別添加果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶、淀粉酶、復(fù)合酶,以不添加酶的水提仙人掌粉作為空白對(duì)照。在各種酶最適 pH和溫度下進(jìn)行提取,根據(jù)檢測(cè)各階段仙人掌粉提取液中可溶性固形物的含量和多糖含量,確定最佳用酶。

1.2.3 不同酶解時(shí)間對(duì)仙人掌粉有效成分含量的影響 對(duì)每種酶進(jìn)行六個(gè)不同酶解時(shí)間的研究,按 1.2.1所示工藝流程進(jìn)行反應(yīng),根據(jù)檢測(cè)各階段仙人掌粉中提取液可溶性固形物的含量和多糖含量確定最佳酶解時(shí)間,反應(yīng)時(shí)間分別為 20、40、60、80、100、120min。

1.2.4 提取液中多糖和蛋白含量測(cè)定

1.2.4.1 多糖的測(cè)定 采用 Dubois[7]法,即苯酚-硫酸法。用分析純葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=[(X+0.0049)/0.0101]×稀釋倍數(shù) (相關(guān)系數(shù)r=0.9999),其中:X代表吸光度值,Y代表葡萄糖溶液濃度(μg/mL)。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)測(cè)定 采用 Folin-酚法測(cè)定。用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為 X=[(Y-0.0415)/0.0027]×稀釋倍數(shù) (相關(guān)系數(shù) r=0.9969),其中:X代表牛血清蛋白溶液濃度(μg/mL),Y代表吸光度值。

1.2.5 仙人掌提取液抗敏功效檢測(cè) 本方法采用透明質(zhì)酸酶體外抑制實(shí)驗(yàn) Elson-Morgan法[8-9]測(cè)定抗過(guò)敏功效。透明質(zhì)酸酶是過(guò)敏反應(yīng)的參與者,研究表明透明質(zhì)酸酶與炎癥、過(guò)敏有強(qiáng)相關(guān)性,許多抗過(guò)敏藥物有強(qiáng)抑制透明質(zhì)酸酶活性的作用。透明質(zhì)酸酶能夠不加選擇地水解透明質(zhì)酸中的β-N-乙酰葡糖胺與D-葡糖醛酸鹽之間的 1,4-鍵,而得到β-N-乙酰葡糖胺,β-N-乙酰葡糖胺在堿性條件下可以與乙酰丙酮縮合生成生色原 2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物,生色原與對(duì)-二甲氨基苯甲醛在濃鹽酸乙醇中生色?；痉磻?yīng)方程式為:

2-甲基-3-乙酰-吡咯衍生物 +P-DAB→生色(結(jié)構(gòu)不明)

取 0.1mL 0.25mmol/L CaCl2溶液和 0.5mL透明質(zhì)酸酶液,37℃保溫培養(yǎng) 20min;加入樣品液 0.5mL,繼續(xù) 37℃保溫培養(yǎng) 20min;加入 0.5mL透明質(zhì)酸鈉液37℃保溫 30min,常溫放置 5min;加入 0.1mL 0.4mol/L NaOH溶液和 0.5mL乙酰丙酮溶液,置于沸水浴中加熱 15min后,立即用冰水進(jìn)行冷卻 5min;加入埃爾利希試劑 (Ehrlich reagent,稱取 0.8g對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶于 15mL濃鹽酸和 15mL無(wú)水乙醇中)1.0mL并用 3.0mL無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋,放置 20min顯色,用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值。

抗過(guò)敏活性計(jì)算公式為:

式中:A-對(duì)照溶液ABS值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液);B-對(duì)照空白溶液ABS值(用醋酸緩沖溶液代替樣品溶液及酶液);C-試樣溶液ABS值;D-試樣空白溶液ABS值(用醋酸緩沖溶液代替酶液)。

實(shí)驗(yàn)時(shí)先對(duì)A組試樣進(jìn)行450～700nm范圍的波長(zhǎng)掃描,以確定最大吸收波長(zhǎng),然后以去離子水作為參比,在該最大吸收波長(zhǎng)處分別進(jìn)行 ABS值測(cè)定。同一樣品的兩次測(cè)定值之差應(yīng)不超過(guò)兩次測(cè)定平均值的10%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類(lèi)的酶和不同酶解時(shí)間對(duì)仙人掌粉有效含量的影響

在確定最佳酶和酶解時(shí)間過(guò)程中,可溶性固形物含量和多糖含量為兩個(gè)重要參數(shù)。由圖 1可知,添加了六種不同酶的仙人掌粉提取液在相同的提取條件下,可溶性固形物含量在 60min均達(dá)到最大值,其中纖維素酶解液和中性蛋白酶解液的可溶性固形物含量最大;繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,可溶性固形物含量值整體趨于平穩(wěn)。

圖 1 仙人掌粉提取過(guò)程中可溶性固形物含量變化關(guān)系圖

由圖 2可知,添加了六種不同酶的仙人掌粉提取液在相同的提取條件下,多糖含量在 60min均達(dá)到最大值,其中纖維素酶解液的多糖含量最大; 60min后,多糖含量呈下降趨勢(shì)。

圖 2 仙人掌粉提取過(guò)程中多糖量變化關(guān)系圖

由圖 1、圖 2可以確定,最佳添加酶為纖維素酶,最佳酶解時(shí)間為 60min。

2.2 仙人掌纖維素酶解提取液中有效成分比較

由表 2可以看出,仙人掌粉提取液中添加纖維素酶每毫升的多糖含量高于仙人掌粉水提液 8mg/mL,每微升的蛋白質(zhì)含量高于仙人掌粉水提液 8.3μg/mL。說(shuō)明纖維素酶有助于提高仙人掌粉中多糖、蛋白質(zhì)的提取。

表 2 仙人掌粉提取液多糖、蛋白質(zhì)含量對(duì)比

2.3 仙人掌提取液抗敏功效檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)對(duì) 22種中草藥提取物的抗敏功效進(jìn)行了檢測(cè),提取物均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。將各種草藥配制為濃度均為 1%的水溶液,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 3。

表 3 22種中草藥透明質(zhì)酸酶抑制率(%)

在 22種實(shí)驗(yàn)原料中,抗過(guò)敏效果相對(duì)較好的實(shí)驗(yàn)原料透明質(zhì)酸酶抑制率依次是:仙人掌凍干粉提取物 97.0%,茶多酚 93.2%,葡萄籽 72.5%,麥冬71.3%,槲皮素 67.4%。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)仙人掌粉提取工藝采用水提法,但由于仙人掌細(xì)胞粗大,壁厚,有效成分難以從胞內(nèi)擴(kuò)散出來(lái),需要多次浸提,操作時(shí)間長(zhǎng),收率低。本實(shí)驗(yàn)利用酶促反應(yīng)高效特異性、條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高、副產(chǎn)物少的特點(diǎn),采用了生物技術(shù)代替化學(xué)方法,工藝簡(jiǎn)便、省時(shí),再加上酶解條件和離子交換條件的優(yōu)化,使有效成分的提取率有一定的提高,并且產(chǎn)品安全性高。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,纖維素酶酶解法優(yōu)于其他各種酶。這主要原因是因?yàn)橹参锛?xì)胞壁由大量纖維素構(gòu)成,纖維素酶可有效溶解植物細(xì)胞壁,使植物細(xì)胞內(nèi)的生物功能性成分可以被有效提取,對(duì)于仙人掌的綜合開(kāi)發(fā)利用及提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有實(shí)際意義。

目前抗敏人群數(shù)量急劇增多,但據(jù)市場(chǎng)調(diào)查分析發(fā)現(xiàn),在當(dāng)今食品市場(chǎng)中宣稱抗敏的添加劑較少,真正有效的抗敏添加劑更少。本論文在充分調(diào)研我國(guó)中藥功效的基礎(chǔ)上,以期通過(guò)結(jié)合體外生化和人體實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)出安全,穩(wěn)定功效顯著的抗敏植物食品添加劑。

綜合以上分析,采用纖維素酶,酶解條件:溫度50℃,pH為 5,E/S為 1%,固液比為 1∶20,酶解時(shí)間為 1h的條件下提取,得穩(wěn)定澄清的仙人掌提取液,有效成分提取率優(yōu)于傳統(tǒng)的水提方法。

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Study on opti m ization of the extraction technology of cactus powder and efficacy evaluation of its anti-allergy

ZHAO Hua,PI Nan,HE Cong-fen,WANG Ha i-tao,L IW ei,DONG Y i n-mao＊
(Beijing KeyLaboratory of Plant Resources Research and Development, Beijing Technology and BusinessUniversity,Beijing 100037,China)

[O b jec tive]Op ti m iza tion of the extrac tion technology of cac tus p owde r and efficacy eva lua tion of its anti-a lle rgy,and it was exp ec ted theresults could g ive bas ic consulta tion on the deve lopm ent anti-a lle rgy func tiona l food by cac tus extrac tion.[M e thod]The ac tive ing red ients from cac tus we re extrac ted by enzym eass is ted m e thod.And the m e thod of hya luronidase inhib ition in vitro was used for eva lua tion the effec tiveness of its anti-a lle rgy.The results ind ica ted tha t the Ce llulase was the bes t one am ong Neutra lp rotease,Protam ex,Pec tinase and high-temp e ra ture am ylase for extrac tion the ac tive ing red ients from cac tus and the op ti m iza tion cond itions we re the temp e ra ture of50℃,pH of5,Ce llulase /Cac tus p owde r of0.15u/mL,solid-liquid ra tio of1∶20,and hyd rolys is ti m e for1h.Cac tus extrac tion by Ce llulase was the bes t for the anti-a lle rgy effec t am ong22kinds of Chinese M ed ic ine extrac tion.[Conc lus ion]Cac tus wa te r extrac tion from freeze-d ried p owde r had exce llent anti-a lle rgy effec ts.

cac tus p owde r;enzym e-ass is ted extrac tion;p rocess ing op ti m iza tion;anti-a lle rgy effec ts

TS201.2

A

1002-0306(2010)05-0305-03

2010-01-07 ＊通訊聯(lián)系人

趙華(1965-),男,博士研究生,副教授,研究方向:天然產(chǎn)物分離及應(yīng)用。

國(guó)家“863”資助項(xiàng)目(2007AA100404)。