五倍子單寧的超聲提取工藝優(yōu)化

江凱，李建科

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710062)

五倍子單寧的超聲提取工藝優(yōu)化

江凱1，李建科2

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710062)

通過正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了五倍子單寧(Chinese Gallotannins，CGTs)的超聲波提取條件，同時(shí)對(duì)五倍子單寧進(jìn)行了純化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:CGTs的最佳提取條件為，超聲功率200 W，丙酮體積分?jǐn)?shù)60%，液料比24∶1(mL∶g)，超聲時(shí)間30min，提取溫度40℃;最佳條件下，提取2次就可以達(dá)到CGTs的最大提取量92.27%。有機(jī)溶劑法純化CGTs后純度達(dá)到92.89%。

正交實(shí)驗(yàn)法，五倍子單寧，超聲波提取，純化

五倍子(Galla chinensis)為倍蚜科昆蟲角倍蚜或蛋倍蚜在其寄主漆樹科植物鹽膚木(Rhus chinensis)、青麩楊(P.potaninii)或紅麩楊(R.punjabensis)等樹上形成的干燥蟲癭。五倍子產(chǎn)于亞洲東部和北美洲的美國(guó)、加拿大等國(guó)家。我國(guó)是五倍子主產(chǎn)國(guó)，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的95%，其中四川、貴州、湖南、湖北、陜西和云南6省的產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的80%左右，我國(guó)五倍子的現(xiàn)年產(chǎn)量約為5 000 t［1］。五倍子是中國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥，外用消炎、止血、鎮(zhèn)痛、去腫，治療痔瘡和腳氣，內(nèi)服治療消化性潰瘍、急慢性胃炎等［2］。五倍子的化學(xué)成分主要包括單寧、五倍子油、樹脂、蛋白質(zhì)、脂肪物質(zhì)、淀粉、蠟質(zhì)、礦物質(zhì)等。其中，五倍子單寧(Chinese Gallotannins，CGTs)是五倍子的主要功能成分，并且是五倍子中含量最多的組分［3］。

文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，CGTs的研究涉及到提取純化［4－6］、抗氧化［7］、抑菌［8］、組成成分分析［9－10］、結(jié)構(gòu)鑒定［11］等領(lǐng)域。同時(shí)也有文獻(xiàn)比較詳細(xì)的討論了CGTs在不同極性溶劑中表現(xiàn)出不同的抗菌和體外抗氧化活性［12］。由此可見，CGTs在生物活性方面的研究比較多，而且比較深入，對(duì)于CGTs提取方面的研究主要集中在不同提取溶劑的選擇上［4－5］。本文采用正交法對(duì)超聲波輔助提取CGTs的提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、提取溫度、超聲功率等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)還進(jìn)行了CGTs純化試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

五倍子，購于陜西漢中肚倍(potanin sumac nutgall)。

1.1.2 化學(xué)試劑

丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、氯化銨、氨水、EDTA、乙酸鋅、鉻黑T指示劑等均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.1.3 要儀器設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)(型號(hào)FW400A)，北京科偉永興儀器有限公司;離心機(jī)(TDL－4型)，上海安亭科學(xué)儀器廠;電熱恒溫水浴鍋:(HH－S4型)，北京科偉永興儀器有限公司;臺(tái)式恒溫振蕩器(THZ-D型);江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DB型)，昆山市超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA)，上海亞榮生化儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ型)，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;真空冷凍干燥機(jī)(ALPHA1-4型)，德國(guó)CHRTST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五倍子單寧的提取工藝

五倍子→干燥→粉碎→過篩→超聲提取→過濾→離心→上清液→減壓蒸餾回收溶劑→單寧粗品→純化富集→真空冷凍干燥→單寧產(chǎn)品

1.2.2 操作要點(diǎn)

五倍子，破殼，去尸，于干燥箱中50℃鼓風(fēng)干燥24 h，用FW400A萬能粉碎機(jī)粉碎50 s，顆粒粒度為60～120目，將五倍子粉末置于棕色瓶中，干燥、避光保存。

稱取2.5 g五倍子粉置于錐形瓶中，加入丙酮溶液，用保鮮膜封口，在膜上扎一些小孔，采用KQ－250DB型超聲波清洗器進(jìn)行超聲輔助提取，真空抽濾，濾液經(jīng)4 000 r/min離心15 min。

1.2.3 單寧含量測(cè)定方法

采用EDTA絡(luò)合滴定法［13］測(cè)定單寧含量。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以丙酮為提取溶液、選用超聲波輔助提取工藝中對(duì)提取率有影響的5個(gè)因素，即丙酮體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間、提取溫度、超聲功率、進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，按照1.2.3方法提取五倍子單寧，并計(jì)算得率。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取最佳超聲功率200 W，確定丙酮體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)、和提取溫度(D)作為考察因素，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)考察4個(gè)因素對(duì)單寧得率的影響，對(duì)CGTs提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.6 優(yōu)化條件下五倍子單寧(CGTs)的超聲波提取次數(shù)實(shí)驗(yàn)

在1.2.6中正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的提取參數(shù)條件下，對(duì)第一次五倍子提取的濾渣進(jìn)行二次提取，研究CGTs得率與提取次數(shù)之間的關(guān)系。

1.2.7 五倍子單寧(CGTs)的純化實(shí)驗(yàn)

取五倍子單寧粗提液，用一倍體積氯仿連續(xù)萃取3次，收集水相;然后加入二倍體積的乙酸乙酯，45℃搖床振蕩30min，靜置分層，收集乙酸乙酯相，再于40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙酸乙酯后，真空冷凍干燥，得到五倍子單寧成品［5，14］，同時(shí)測(cè)定產(chǎn)品得率、單寧得率、單寧純度。

產(chǎn)品得率/%=(產(chǎn)品質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100單寧得率/%=(產(chǎn)品中單寧含量/原料質(zhì)量)×100單寧純度/%=(產(chǎn)品中單寧含量/產(chǎn)品質(zhì)量)×100

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

丙酮-水對(duì)單寧的溶解能力最強(qiáng)，能夠打開植物內(nèi)單寧-蛋白質(zhì)的連接鍵，使單寧的提取率提高并且減壓蒸發(fā)很容易將丙酮從浸提液中去掉，剩下單寧的水溶液［15］，因此本實(shí)驗(yàn)采用丙酮-水作為提取溶劑。由圖1可知，當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)在30%～60%內(nèi)時(shí)，CGTs得率隨丙酮濃度的增加而增大，體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)得率反而下降。因此選定丙酮體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%作為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖1 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)CGTs得率的影響

2.1.2 液料比對(duì)提取效果的影響

由圖2可知，液料比在24∶1以下時(shí)，CGTs得率隨著液料比的增加而呈上升趨勢(shì)，液料比超過24∶1后，CGTs得率反而下降。隨著丙酮溶液的增加，CGTs的溶解量也增加，當(dāng)丙酮溶液達(dá)到一定量時(shí)，CGTs溶解已經(jīng)達(dá)到飽和，再增加丙酮溶液也不會(huì)使CGTs含量增加，但此時(shí)伴隨著單寧溶出的雜質(zhì)卻增多，從而導(dǎo)致有效成分的相對(duì)含量減少。因此選定液料比16∶1、24∶1和32∶1作為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖2 液料比對(duì)CGTs得率的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，CGTs得率隨之升高，但時(shí)間超過35 min后，變化緩慢且得率略有降低。從生產(chǎn)角度考慮，CGTs的提取時(shí)間以35 min左右為宜。因此選定超聲時(shí)間30、35、40 min作為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.1.4 提取溫度對(duì)提取效果的影響

由圖4可知，提取溫度在30～45℃內(nèi)時(shí)，CGTs得率隨溫度升高而增大，溫度超過45℃時(shí)得率反而下降。溫度的升高有助于CGTs的浸出，但單寧含有大量酚羥基，對(duì)溫度較為敏感，熱穩(wěn)定性差［15］，當(dāng)溫度超過一定范圍時(shí)，一方面CGTs溶解量可能會(huì)因溶解度降低而減少，另一方面單寧可能由于不穩(wěn)定而發(fā)生其他不可逆的化學(xué)反應(yīng)，從而最終導(dǎo)致得率的降低。因此選定提取溫度40、45、50℃作為正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)CGTs得率的影響

圖4 提取溫度對(duì)CGTs得率的影響

2.1.5 超聲功率對(duì)提取效果的影響

在超聲提取實(shí)驗(yàn)中，超聲功率是重要的選擇參數(shù)，一般來說，超聲波所產(chǎn)生的空化效應(yīng)、粉碎、破壁等作用可以有效的增加提取率［16］。由圖5可知，CGTs得率隨著超聲功率的增大而增大，在功率超過200 W時(shí)，CGTs得率增幅較小，趨于平緩。由于提取包括擴(kuò)散、滲透、溶解等過程，提取功率愈大，提取愈完全，但當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，增大超聲功率，提取率不再增大，所以超聲功率采用200 W。

2.2 超聲波提取CGTs的正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2的方差分析可知，以上4個(gè)因素對(duì)CGTs得率的影響大小依次為B(液料比)＞A(丙酮體積分?jǐn)?shù))＞D(提取溫度)＞C(超聲時(shí)間)，液料比和丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響較為顯著。超聲提取CGTs的最佳條件為A2B2C1D1，即丙酮體積分?jǐn)?shù)60%、液料比24∶1、超聲時(shí)間30min、提取溫度40℃。

圖5 超聲功率對(duì)CGTs得率的影響

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

在優(yōu)化工藝條件下，分別超聲提取3份2.5 g五倍子，測(cè)得 CGTs得率分別為:708.3、707.9、709.7 mg/g。平均得率為708.6 mg/g。大于正交實(shí)驗(yàn)中所有實(shí)驗(yàn)組所測(cè)得率，故認(rèn)為最佳工藝條件可行。

2.4 優(yōu)化條件下五倍子單寧(CGTs)提取次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6可知，經(jīng)過反復(fù)提取，CGTs得率有所增加。第2次提取后得率達(dá)到719.6 mg/g，比第1次增加了11.6 mg/g，第3次為720.9 mg/g，較第2次增大幅度不明顯，僅為1.3 mg/g。隨著提取次數(shù)繼續(xù)增加，CGTs得率逐漸趨于平穩(wěn)而不再增加，表明CGTs已基本提出，因此，從生產(chǎn)成本考慮，CGTs的提取以2次為宜。

2.5 五倍子單寧(CGTs)純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

量取200mL的CGTs粗提液，按照1.2.6方法進(jìn)行富集純化。實(shí)驗(yàn)測(cè)得，產(chǎn)品得率為244.7mg/g，單寧得率為227.3mg/g，CGTs純度達(dá)到92.89%。溶劑萃取法是一種常見的分離純化方法，由于水的極性大，五倍子中又含有水溶性的樹脂、蛋白質(zhì)、淀粉等，伴隨著單寧溶出的雜質(zhì)也較多，而乙酸乙酯能夠溶解多種水解單寧及低聚的縮合單寧且對(duì)其他雜質(zhì)無溶解能力，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯做為萃取溶劑，在一定溫度下，搖床振蕩富集純化CGTs。與文獻(xiàn)相比較［5］，CGTs的純度有很明顯的提高。

圖6 優(yōu)化條件下提取次數(shù)對(duì)CGTs得率的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化CGTs的最佳工藝條件，確定最佳提取工藝為:超聲功率200 W、丙酮體積分?jǐn)?shù)60%、液料比24∶1mL∶g)、超聲時(shí)間30 min、提取溫度 40℃。經(jīng)過 2次提取，CGTs得率達(dá)到719.6 mg/g，提取率為92.27%。乙酸乙酯萃取后CGTs純度達(dá)到92.89%。與文獻(xiàn)相比較［4］，超聲波輔助提取處理時(shí)間不僅比水浴浸提法大大減少，而且CGTs得率有很明顯的提高。

［1］李志國(guó)，楊文云，夏定久.中國(guó)五倍子研究現(xiàn)狀［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2003，16(6):760－767.

［2］傅春升，殷佳，朱青.五倍子的臨床應(yīng)用［J］.中藥天地，2000，9(6):28－29.

［3］李秀萍，李春遠(yuǎn)，渠桂榮，等.五倍子的研究概況［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002，30(3):72－74.

［4］孔琪.五倍子鞣質(zhì)的提取及抑制亞硝化反應(yīng)的初步研究［J］.應(yīng)用科技，2005，32(9):62－64.

［5］帥益武，尤玉如，袁海娜.五倍子中鞣質(zhì)的提取、分離純化研究［J］.食品科技，2007，(6):125－128.

［6］陳笳鴻，汪詠梅，吳冬梅，等.單寧酸純化技術(shù)的研究開發(fā)［J］.現(xiàn)代化工，2008，28(2):301－303.

［7］Cai Yi-zhong，Sun Mei，Xing Jie，et al.Structure-radical scavenging activity relationships of phenolic compounds from traditional Chinese medicinal plants［J］.Life Sciences，2006，78(25):2 872－2 888.

［8］劉現(xiàn)兵，杜鎮(zhèn)鎮(zhèn)，王冬.五倍子的體外抑菌作用研究［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008，3(7):96－97.

［9］Xiang P，Lin Y M，Lin P，et al.Effect of cationization reagents on the.matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrum of Chinese gallotannins［J］.Journal of Applied Polymer Science，2007，105:859－864.

［10］Tian Fang，Li Bo，Ji Baoping，et al.Identification and structure-activity relationship of gallotannins separated from Galla chinensis［J］.LWT-Food Science and Technology，2009，42(7):1 289－1 295.

［11］Beasley T H，Ziegler H W，Bell A D.Determination and characterization of gallotannin by high performance liquid chromatography［J］.Analytical Chemistry，1977，49(2):238－243.

［12］Tian Fang，Li Bo，Ji Baoping，et al.Antioxidant and antimicrobial activities of consecutive extracts from Galla chinensis:The polarity affects the bioactivities［J］.Food Chemistry，2009，113(1):173－179.

［13］陳大全，王昌利，王劍波，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選元寶楓果殼中鞣質(zhì)的提取工藝研究［J］.中草藥，2006，37(12):1 816－1 817.

［14］黃秋森.有機(jī)溶劑提取萃取法生產(chǎn)茶多酚工業(yè)試驗(yàn)［J］.現(xiàn)代化工，2006，26(9):48－51.

［15］何蘭，姜志宏.天然產(chǎn)物資源化學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2008:465－495.

［16］譚勝兵.超聲波技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用［J］.食品工程，2007，2(6):47－50.

Orthogonal Array Design Tests for Optimizing Ultrasonicwave Extraction of Chinese Gallotannins

Jiang Kai1，Li Jian-ke2
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi＇an 710062，China)

Orthogonal array design was employed to optimize the ultrasonic extraction of Chinese Gallotannins(CGTs)，and the purification process of CGTs was also studied in this paper.The optimal extraction condition of CGTs were as follows:ultrasonic power was 200 W，60%acetone as extractant，liquid-to-solid ratio is 24∶1，extraction time was 30 min，temperature was 40℃;The maximum extraction efficiency obtained was 92.27%in two times extraction.The purification degree of CGTs was up to 92.89%with organic solvents.

orthogonal array design，Chinese Gallotannins(CGTs)，ultrasonicwave extraction，purification

碩士研究生(李建科教授為通訊作者，E-mail:jiankel@snnu.edu.cn)。

2010－06－24，改回日期:2010－08－16