乳酸菌包埋方法的研究*

袁秀麗，呂嘉櫪，李旭華

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安，710021)

乳酸菌包埋方法的研究*

袁秀麗，呂嘉櫪，李旭華

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安，710021)

為了研制高活性的乳酸菌載體顆粒，以保加利亞乳桿菌為研究對(duì)象，分別以瓊脂和海藻酸鈉為菌體包埋材料，通過(guò)菌體包埋、載體制備和載體培養(yǎng)等方面條件研究，結(jié)果表明:海藻酸鈉包埋菌體效果優(yōu)于瓊脂，其載體的最佳培養(yǎng)條件為:1%海藻酸鈉，用1%CaCl2固化;將載體置于含1%CaCO3的培養(yǎng)基中，41℃、培養(yǎng)20 h左右時(shí)，載體中活菌數(shù)可高達(dá)2.2×1011CFU/g。

乳酸菌，保加利亞乳桿菌，載體，包埋

乳酸菌作為益生菌中頗具代表的菌群，其產(chǎn)品中乳酸菌的數(shù)量及活力是衡量該類產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)之一。如何制備高菌數(shù)、高活性的乳酸菌產(chǎn)品已成為目前研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。目前常用的濃集乳酸細(xì)菌的方法［1－3］是高密度培養(yǎng)法和分離法，但這2種方法存在操作復(fù)雜，需要借助昂貴的儀器設(shè)備等問(wèn)題，限制了在工業(yè)化生產(chǎn)乳酸菌時(shí)的推廣應(yīng)用。采用高密度培養(yǎng)乳酸菌，在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，目前主要有化學(xué)中和法、緩沖鹽法、透析培養(yǎng)、膜過(guò)濾培養(yǎng)、微膠囊培養(yǎng)法。微膠囊培養(yǎng)法是一種新的培養(yǎng)方法，該法在對(duì)乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)將乳酸菌固定，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物可以自由地通過(guò)微膠囊，同時(shí)又減少了培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損傷和損失，克服了傳統(tǒng)游離細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的缺點(diǎn)和限制，可以獲得較大的菌體密度。本研究借助包埋的方法使乳酸細(xì)菌濃集在海藻酸鈣凝膠載體中生長(zhǎng)繁殖，此方法簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備的要求低，可為制備高活性乳酸細(xì)菌產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，L.B.)，由陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物教研室提供。

1.1.2 試劑與藥品

葡萄糖、NaCl、瓊脂粉、酵母膏、牛肉浸膏、蛋白胨、檸檬酸氫二銨(天富精細(xì)化工有限公司)，K2HPO4、乙酸鈉、吐溫 80、CaCO3、CaCl2、海藻酸鈉、檸檬酸鈉(西安中信精細(xì)化工有限公司)等。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司;PB－10酸度計(jì)，北京賽多利斯天平有限公司;LS—C50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠;顯微攝影系統(tǒng)，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程［4］

瓊脂、海藻酸鈉→滅菌→與菌液混合→造?！袒d體→無(wú)菌水沖洗→培養(yǎng)載體→取出載體→釋放

1.3.2 檢測(cè)與分析方法

(1)包埋載體機(jī)械強(qiáng)度的檢測(cè):取20個(gè)均勻的載體顆粒，用50 g的砝碼加壓，觀察包埋顆粒的外形，若無(wú)變化，為優(yōu);若有裂痕但是外形基本不變，為中;若外形完全被破壞，為差。

(2)包埋載體平均直徑的測(cè)量:取20個(gè)載體顆粒，測(cè)其總長(zhǎng)后計(jì)算出平均值為載體直徑。

(3)pH值測(cè)定:直接用PB－10酸度計(jì)測(cè)定。

(4)海藻酸鈣載體載體中菌體釋放及活菌數(shù)的測(cè)定［5］:將載體中的菌體定向釋放，再按改進(jìn)的高層瓊脂柱法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 瓊脂包埋乳酸菌條件的研究及載體的培養(yǎng)

分別采用滴注法和切割法進(jìn)行造粒，混合前瓊脂溶液的濃度分別為2%、3%、4%，檢測(cè)所得不同載體的形態(tài)與機(jī)械強(qiáng)度。將包埋得到的載體置于培養(yǎng)基中，在41℃下培養(yǎng)，取 12、24、36、48、60、72 h 的培養(yǎng)液測(cè)定pH值及載體中的菌數(shù)。

表1 瓊脂造粒情況

圖1 瓊脂載體培養(yǎng)各時(shí)間段的pH值及載體中活菌數(shù)變化

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，瓊脂溶液在50℃左右時(shí)流動(dòng)性較好，但在造粒的過(guò)程中，隨著注射器中溶液溫度的下降，所造出的載體規(guī)則，表面不光滑，所形成的載體的機(jī)械強(qiáng)度很差。因此，以瓊脂為載體用滴注法包埋乳酸菌的方法不可行。采用切割法造粒，可以得到形態(tài)基本一致的載體，載體的大小基本在3 mm3左右，但載體的機(jī)械強(qiáng)度較低。

培養(yǎng)過(guò)程中，前24 h內(nèi)培養(yǎng)基pH值的變化非常明顯，活菌數(shù)成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，說(shuō)明在這個(gè)階段菌的生長(zhǎng)非常旺盛。后期培養(yǎng)基的pH值及活菌數(shù)變化逐漸趨于平緩，活菌數(shù)由于代謝產(chǎn)物乳酸的積累，培養(yǎng)基pH值降低，導(dǎo)致的生長(zhǎng)逐漸變緩，最大活菌數(shù)達(dá)4.17 ×108CFU/g。

2.2 海藻酸鈉包埋乳酸菌條件的研究及載體的培養(yǎng)［6－9］

將2%與4%的海藻酸鈉溶液與菌液混合后用注射器分別滴入不同濃度的CaCl2溶液中固定0.5～1 h，檢測(cè)載體形態(tài)并將所得載體于40℃培養(yǎng)24 h，檢測(cè)相應(yīng)活菌數(shù)。

表2 海藻酸鈉溶液用CaCl2溶液固化情況

表3 培養(yǎng)不同固化條件形成的載體得到的菌數(shù)(CFU/g)

表2表示的是海藻酸鈉溶液用CaCl2溶液固化的情況，當(dāng)混合液中海藻酸鈉溶液的濃度分別為1%、2%時(shí)，用1%～5%的CaCl2溶液固化均能得到較規(guī)則的球形載體，載體的直徑為2.5～3 mm左右，載體的機(jī)械強(qiáng)度隨著CaCl2溶液濃度的增強(qiáng)而增強(qiáng)，整體的機(jī)械強(qiáng)度均較強(qiáng)。

表3表示的是培養(yǎng)不同固化條件形成的載體得到的菌數(shù)，當(dāng)海藻酸鈉的濃度為1%，固化的CaCl2溶液為1%時(shí)，載體中的菌數(shù)最大，為6.09×109CFU/g。在海藻酸鈣凝膠載體的固化過(guò)程中，雖然CaCl2溶液的濃度越大得到的載體的機(jī)械強(qiáng)度越強(qiáng)，但CaCl2溶液的濃度越大，溶液的滲透壓也越大，這會(huì)對(duì)載體中的菌體產(chǎn)生毒害作用，使菌體的活性降低，不利于菌體的生長(zhǎng)，因此通過(guò)對(duì)比，選取1%的CaCl2溶液作為最佳的固化溶液。

2.3 海藻酸鈣載體培養(yǎng)條件的研究［10－16］

2.3.1 培養(yǎng)基中加入不同濃度的CaCO3培養(yǎng)

包埋方法同上，在載體培養(yǎng)基中加入不同濃度的(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%)CaCO3，不加 CaCO3作為對(duì)照組培養(yǎng)載體時(shí)于不同時(shí)間段測(cè)定載體中的活菌數(shù)及培養(yǎng)液的pH值。

由圖2可見(jiàn)，加CaCO3各組培養(yǎng)液的pH值變化較不加CaCO3組變化趨勢(shì)明顯減小，在培養(yǎng)初至12 h內(nèi)變化較明顯，之后培養(yǎng)液pH值的變化比較平緩，而不加CaCO3組pH值一直降低。表明加CaCO3對(duì)培養(yǎng)液有較好的緩沖作用。而載體中活菌數(shù)變化情況，各組變化趨勢(shì)相似，開(kāi)始一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在20 h時(shí)達(dá)到最大值，為2.1×1011CFU/g(1%CaCO3組)，載體中菌數(shù)在培養(yǎng)的16～20 h內(nèi)變化最為明顯。載體中菌數(shù)的持續(xù)增長(zhǎng)說(shuō)明培養(yǎng)液中加入的CaCO3的確能促進(jìn)載體中菌體的生長(zhǎng)。

圖2 加入不同濃度CaCO3各組培養(yǎng)液pH值及載體中

2.3.2 加入不同接種量的載體培養(yǎng)

包埋方法同上，以5%、10%、20%、30%的接種量將載體加入培養(yǎng)基中，于42℃培養(yǎng)24h，測(cè)各時(shí)間段培養(yǎng)基的pH值及載體中的活菌數(shù)。

圖3 不同接種量組培養(yǎng)液pH值及載體中活菌數(shù)的變化情況

圖3可見(jiàn)接種量為5%與10%，20%與30%的培養(yǎng)液pH值及載體中活菌數(shù)的變化趨勢(shì)類似，pH值均是先降低后維持在一個(gè)pH值范圍之內(nèi)，但加大接種量組pH值較較小接種量組降低明顯。載體中的活菌數(shù)變化趨勢(shì)各組大致相同，載體均培養(yǎng)到20 h達(dá)到最大活菌數(shù)為2.2×1011CFU/mL(接種量為10%組)，然后活菌數(shù)逐漸降低，但20%與30%較5%與10%小一個(gè)數(shù)量級(jí)左右，由此可知最佳接種量約為10%。

3 固定化乳酸菌的活力測(cè)定［17］

將固定化的乳酸菌載體分別投入到200mL三角瓶中，加入150mL牛乳發(fā)酵，測(cè)定凝乳時(shí)間。凝乳時(shí)更換新鮮牛乳，試驗(yàn)共連續(xù)進(jìn)行10批，通過(guò)凝乳時(shí)間的長(zhǎng)短及發(fā)酵乳中pH值來(lái)研究固定化乳酸菌的活力。

由圖4可以看出，固定化的乳酸菌載體在發(fā)酵使用10批后凝乳時(shí)間由3.4 h上升到7.5 h。此試驗(yàn)表明海藻酸鈉包埋的乳酸菌顆粒在發(fā)酵使用10批后任具有較強(qiáng)的發(fā)酵力，并且載體形狀完好。

圖4 凝乳時(shí)間及pH值

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以乳酸菌的包埋、包埋載體的培養(yǎng)為主要內(nèi)容，對(duì)乳酸細(xì)菌的最佳包埋條件進(jìn)行了摸索。包埋的最佳條件為，以海藻酸鈉作為包埋材料，最佳濃度為1%，并以1%CaCl2固化得到的載體呈球形，直徑2.5 mm;載體培養(yǎng)的最佳條件為以10%的接種量將載體培養(yǎng)在加入1%CaCO3的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)間約20 h，載體中的活菌數(shù)達(dá)到最大為2.2×1011CFU/mL，且具有較強(qiáng)的活力。此過(guò)程不需要復(fù)雜、昂貴的儀器設(shè)備且操作簡(jiǎn)單，可廣泛應(yīng)用于其他微生物發(fā)酵劑、菌制劑或微生物產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)之中。

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The Analysis for Lactic Acid Bacteria Encapsulation Methods

Yuan Xiu-li，Lv Jia-li，Li Xu-hua
(College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi＇an 710021，China)

In order to develop the high－activity lactic acid bacteria carrier particles，we used Lactobacillus bulgaricus as study object and agar and sodium alginate being the cell encapsulation materials respectively.This article focuses on the following conditions:cell encapsulation，carrier preparation and carrier culture and so on.The results show that:the encapsulation effect by sodium alginate is better than agar and the optimum culture conditions is:1%sodium alginate solidified by1%CaCl2;with placing the carrier into the culture medium containing 1%CaCO3，41℃and 20 hours more or less，total viable count in the carrier is up to 2.2 ×1011CFU/g.

Lactic acid bacteria，Lactobacillus bulgaricus，vector，encapsulation

碩士研究生。

*陜西省“13115”項(xiàng)目(2009ZDKG－20);固定化法制備高菌濃乳酸菌的研究(2010JK446)

2010－06－07，改回日期:2010－09－15