蛹蟲(chóng)草菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中氨基酸添加技術(shù)研究

賁松彬，李惠嬌，黃子琪，桑育黎，孟程程，侯 瀟，牟 藤，陳長(zhǎng)蘭,*

(1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.遼寧大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

蛹蟲(chóng)草菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中氨基酸添加技術(shù)研究

賁松彬1，李惠嬌2，黃子琪1，桑育黎2，孟程程1，侯 瀟1，牟 藤1，陳長(zhǎng)蘭2,*

(1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.遼寧大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

組氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸是對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)影響較大的3種堿性氨基酸，本實(shí)驗(yàn)研究在蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵過(guò)程中添加上述氨基酸的不同條件對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體生物量和其中主要抗癌功能成分蟲(chóng)草素的影響。首先進(jìn)行添加氨基酸種類(lèi)、氨基酸的添加量、初始pH值、培養(yǎng)溫度對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體生物量和蟲(chóng)草素含量的單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體生物量影響從大到小的順序依次是：氨基酸種類(lèi)＞培養(yǎng)溫度＞初始pH值＞氨基酸添加量。增加蛹蟲(chóng)草菌絲體生物量的最佳培養(yǎng)條件為：添加氨基酸種類(lèi)為精氨酸，培養(yǎng)溫度為26℃，培養(yǎng)初始pH值為6，100mL PDA發(fā)酵培養(yǎng)液添加精氨酸0.3g。對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體中蟲(chóng)草素含量影響從大到小的順序依次是：氨基酸種類(lèi)＞初始pH值＞培養(yǎng)溫度＞氨基酸添加量。增加菌絲體中蟲(chóng)草素含量的最佳培養(yǎng)條件是添加氨基酸種類(lèi)為精氨酸，培養(yǎng)溫度為24℃，100mL PDA發(fā)酵培養(yǎng)液添加0.3g，培養(yǎng)的初始pH值為6。

蛹蟲(chóng)草；蟲(chóng)草素；氨基酸；添加工藝

蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militarisL. Link.)又名北蟲(chóng)草、蛹草、北冬蟲(chóng)夏草，屬子囊菌亞門(mén)、核菌綱、球殼菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬[1]，其主要藥用成分有蟲(chóng)草多糖類(lèi)[2-6]、氨基酸類(lèi)、糖醇和甾醇類(lèi)[7-11]、蟲(chóng)草素(cordycepin，化學(xué)結(jié)構(gòu)為3＇-脫氧腺苷(3＇-deoxyadenosine))等核苷類(lèi)化合物[12-14]、肽類(lèi)、維生素類(lèi)[8]以及無(wú)機(jī)元素及其他類(lèi)物質(zhì)。蟲(chóng)草及蟲(chóng)草菌絲體制劑能明顯提高機(jī)體的免疫功能[15]，具有抗腫瘤作用[16-17]、鎮(zhèn)靜作用[18]、抗放療作用[19]，以及對(duì)心腦血管、腎病的治療作用和延緩衰老的作用[20-24]。

氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)并同生命活動(dòng)有關(guān)的最基本的物質(zhì)，是在生物體內(nèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，與生物的生命活動(dòng)有著密切的關(guān)系。它在體內(nèi)具有特殊的生理功能，是生物體內(nèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分之一。Masuda等[25]發(fā)現(xiàn)在液體發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)添加甘氨酸，L-天門(mén)冬氨酸以及L-谷氨酰胺可以提高蛹蟲(chóng)草的產(chǎn)量，最大可以達(dá)到2.5g/L。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在蛹蟲(chóng)草液體培養(yǎng)液中添加組氨酸、精氨酸和賴(lài)氨酸3種堿性氨基酸，探討添加堿性氨基酸對(duì)于蛹蟲(chóng)草菌絲體生長(zhǎng)的影響，以及對(duì)蛹蟲(chóng)草中主要抗癌成分蟲(chóng)草素含量的影響，并通過(guò)多因素多水平的正交試驗(yàn)對(duì)最佳添加技術(shù)進(jìn)行研究，以便達(dá)到提高蛹蟲(chóng)草菌絲體培養(yǎng)效率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；乙腈和甲醇(色譜純) 漢邦科技有限公司進(jìn)口分裝；氨水、NaOH、鹽酸等均為分析純。

DHG-9146電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)制備有限公司；PB-10 pH計(jì)北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LabAlliance 3500G高效液相色譜儀 美國(guó)SSI公司；SW-GJ-2FD 潔凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；681 磁力加熱攪拌器 上海南匯電訊器材廠；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)科峻儀器公司；HZS-H型水浴振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子開(kāi)發(fā)有限公司；RE5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

蛹蟲(chóng)草菌L4由本實(shí)驗(yàn)室自行分離(子實(shí)體來(lái)自沈陽(yáng)市蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基地)。

斜面培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：蔗糖5.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%；PDA發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆20.0%、葡萄糖2.0%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、瓊脂2.0%、VB11mg/L。

1.3 蛹蟲(chóng)草液體培養(yǎng)方法

1.3.1 發(fā)酵種子制備

先將制備好的斜面培養(yǎng)基上的母種用接種鏟取一塊約2 0 m m2大小的菌苔接入種子培養(yǎng)基(裝樣量為100mL/300mL三角瓶)中，在26℃、130r/min恒溫振蕩器上發(fā)酵3d，形成微小的菌球。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

采用搖瓶培養(yǎng)，在300mL三角瓶中裝入100mL PDA發(fā)酵液，121℃、20min滅菌后接入培養(yǎng)3d的種子發(fā)酵液5mL，培養(yǎng)溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速130r/min，培養(yǎng)時(shí)間為5 d。

1.4 添加氨基酸培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)

1.4.1 添加氨基酸種類(lèi)對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

氨基酸作為有機(jī)氮源，對(duì)蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)會(huì)起到一定的作用。為考察添加不同氨基酸對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響，在100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入組氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸各0.2g[5]，并作空白對(duì)照。在26℃，pH值自然，130r/min的條件下，培養(yǎng)5d，測(cè)定其生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量。

1.4.2 氨基酸添加量對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

添加精氨酸使蛹蟲(chóng)草生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高最顯著，為考察精氨酸促進(jìn)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)和提高蟲(chóng)草素產(chǎn)量的最佳用量，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g的精氨酸，在26℃，pH值自然，130r/min的條件下，培養(yǎng)5d，測(cè)定其生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量。

1.4.3 初始pH值對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量和蟲(chóng)草素含量的影響

蛹蟲(chóng)草深層液體培養(yǎng)要求適宜的pH值。為考察不同初始pH值對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響，將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值用2mol/L的HCl和2mol/L的NaCl分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9，添加精氨酸的量為0.2g，在26℃、130r/min的條件下，培養(yǎng)5d，測(cè)定其生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量。

1.4.4 溫度對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

溫度會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)酶活性和發(fā)酵液的溶氧量。很多蟲(chóng)生真菌的最適生長(zhǎng)溫度都在20～30℃之間。為考察不同溫度對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響，將培養(yǎng)溫度分別定為22、24、26、28、30℃，在初始pH7.0，130r/min的條件下，培養(yǎng)5d，測(cè)定其生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量。

1.5 添加氨基酸培養(yǎng)條件的四因素三水平正交試驗(yàn)

在根據(jù)單因素試驗(yàn)大致確定最佳實(shí)驗(yàn)條件后，以氨基酸種類(lèi)、氨基酸濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)酸堿度做四因素三水平的正交試驗(yàn)。

1.6 菌絲體生物量的測(cè)定

采用干質(zhì)量法。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液抽濾，分離得到菌絲體用蒸餾水沖洗2次后放入60℃烘箱烘12h至質(zhì)量恒定，稱(chēng)量記錄干菌質(zhì)量，用干菌絲得率η(即蛹蟲(chóng)草生物量)來(lái)表示。

式中：η為干菌絲得率/(g/L)；m為干菌絲質(zhì)量/g；V為發(fā)酵液體積/L。1.7 蟲(chóng)草素產(chǎn)量測(cè)定

1.7.1 蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品5mg，超純水溶解定容至10mL，配制成500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再將其稀釋成10、20、40、60、80、100μg/mL蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)液，待測(cè)定。

1.7.2 蟲(chóng)草素產(chǎn)量的HPLC測(cè)定

HPLC測(cè)定：所用高效液相色譜儀為美國(guó)SSI公司的LabAlliance 3500G型高效液相色譜儀，色譜柱采用Waters Nova-pak C18(4.6mm×250mm)；檢測(cè)器為CS420x HARDWARE型；檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm；柱溫35℃；流動(dòng)相：乙腈、超凈水(體積分?jǐn)?shù)=15:85)；流速為1mL/min；進(jìn)樣量為20μL。

1.7.3 蟲(chóng)草素提取

將干菌絲研細(xì)粉進(jìn)行微波提取，向150mL三角瓶中加入0.25g樣品，再加25mL生理鹽水(容量瓶定容)，微波中火(500W)處理2min，反復(fù)進(jìn)行兩次，將提取液12000r/min離心6min，上清液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾器壓濾，定容到25 mL，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加氨基酸培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 添加氨基酸種類(lèi)對(duì)菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

圖1 氨基酸種類(lèi)對(duì)菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of amino acid type on the growth of mycelium and the production of cordycepin during the fermentation processand that of cordycepin

氨基酸作為蛋白質(zhì)的組成成分，參與蛋白質(zhì)的代謝，可以起到促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。由圖1可知，添加氨基酸的培養(yǎng)液中菌絲體生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量明顯提高，其中添加精氨酸的培養(yǎng)液中菌絲體生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高最大，其菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量由空白對(duì)照(不添加處理)的7.19g/L(培養(yǎng)液)和2.01mg/g(菌絲體干質(zhì)量)提高到14.82g/L和5.84mg/g。其次是組氨酸和賴(lài)氨酸，添加組氨酸的處理組菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高到11.24g/L和5.67mg/g，添加賴(lài)氨酸的處理菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高到13.52g/L和4.23mg/g。

2.1.2 氨基酸添加量對(duì)菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

圖2 精氮酸添加量對(duì)菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of amino acid addition amount on the growth of mycelium and the production of cordycepin during the fermentation process

由圖2可知，精氨酸的添加量對(duì)菌絲體生物量及蟲(chóng)草素的產(chǎn)量都有很大影響。添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g的精氨酸后蛹蟲(chóng)草的菌絲體生物量分別從不添加處理的7.19g/L上升到15.80、14.57、15.40、14.97、13.06、8.97g/L，菌絲體中蟲(chóng)草素含量從不添加處理的2.15mg/g上升到4.13、5.87、3.82、3.82、3.92、2.73mg/g。添加0.1g的精氨酸適于蟲(chóng)草素菌絲體生長(zhǎng)。添加0.2g的精氨酸適于生產(chǎn)蟲(chóng)草素。隨著精氨酸添加量的進(jìn)一步提高，菌絲體的生物量與蟲(chóng)草素的產(chǎn)量并沒(méi)有隨之提高，反而開(kāi)始下降。

2.1.3 初始pH值對(duì)菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

圖3 初始pH值對(duì)菌絲體生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of initial pH on the growth of mycelium and the production of cordycepin during the fermentation process

由圖3可知，由于培養(yǎng)液中的pH值會(huì)影響到細(xì)胞內(nèi)pH值的變化，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性，也影響到蛹蟲(chóng)草菌對(duì)一些微量元素的利用，所以培養(yǎng)液的初始pH值對(duì)菌絲體生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量均有很大影響。培養(yǎng)液初始p H值為3、4、5、6、7、8、9時(shí)培養(yǎng)液中的菌絲體生物量分別為3.41、9.03、12.33、13.27、14.02、10.32、5.50g/L，菌絲體中蟲(chóng)草素含量分別為1.41、3.96、4.35、4.02、4.77、3.41、2.01mg/g。適于蛹蟲(chóng)草細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)蟲(chóng)草素的最佳初始pH值同為7.0。

2.1.4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲體生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the growth of mycelium and the production of cordycepin during the fermentation process

由圖4可知，培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲體生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量有很大影響。培養(yǎng)溫度為22、24、26、28、30℃時(shí)培養(yǎng)液中的菌絲體生物量分別為7.44、12.00、14.90、13.21、6.35g/L，菌絲體中蟲(chóng)草素含量分別為2.69、3.88、4.15、4.77、3.94mg/g。適于蛹蟲(chóng)草菌絲體生長(zhǎng)的最佳溫度為26℃，而產(chǎn)蟲(chóng)草素的最佳溫度為28℃。

2.2 添加氨基酸培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，擬定添加氨基酸影響蛹蟲(chóng)草液體培養(yǎng)生產(chǎn)蟲(chóng)草素的4個(gè)因素即A(添加氨基酸種類(lèi))、B(氨基酸添加量)、C(初始pH值)、D(培養(yǎng)溫度)為優(yōu)選因素，每個(gè)因素選3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)條件見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

從菌絲體生長(zhǎng)量的偏差平方和和F比值可以看出(表2)，影響蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)量的因素由大到小依次為：添加氨基酸種類(lèi)＞培養(yǎng)溫度＞初始pH值＞添加氨基酸量；從菌絲體生物量的均值可看出，最佳培養(yǎng)條件的組合為A2B3C1D2，即添加氨基酸種類(lèi)為精氨酸，添加量為0.3g，培養(yǎng)的初始pH值為6，培養(yǎng)溫度為26℃。

從蟲(chóng)草素產(chǎn)量的偏差平方和和F比值可以看出(表2)，影響蛹蟲(chóng)草菌絲體中蟲(chóng)草素含量的因素由大到小依次為：添加氨基酸種類(lèi)＞初始pH值＞培養(yǎng)溫度＞添加氨基酸量；從蟲(chóng)草素產(chǎn)量可以看出，最佳培養(yǎng)條件的組合為A2B3C1D1，即添加氨基酸種類(lèi)為精氨酸，添加量為0.3 g，培養(yǎng)的初始p H值為6，培養(yǎng)溫度為24℃。

表2 添加氨基酸培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草的四因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Result analysis of orthogonal experiments

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)以上添加氨基酸對(duì)菌體生物量和蟲(chóng)草素生產(chǎn)最優(yōu)培養(yǎng)條件，即對(duì)菌體生物量的影響的最優(yōu)組合為A2(精氨酸)、B2(0.3g)、C1(pH6)、D2(培養(yǎng)溫度為 26℃)，對(duì)菌絲體中蟲(chóng)草素產(chǎn)量影響的最優(yōu)組合為A2(精氨酸)、B3(0.3g)、C1(pH6)、D1(培養(yǎng)溫度為24℃)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)所確定的最佳條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 3 Validation of orthogonal experimental results

由表3可知，最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)組合與對(duì)照組相比均能提高蛹蟲(chóng)草的菌絲體生物量以及提高其生產(chǎn)蟲(chóng)草素的能力。處理組合的菌絲體生物量和蟲(chóng)草素含量分別達(dá)到對(duì)照的237.5%和245.1%，差異極顯著。

3 討 論

氨基酸作為蛋白質(zhì)的組成成分，參與蛋白質(zhì)的代謝，可以起到促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，添加氨基酸，尤其是精氨酸后，蛹蟲(chóng)草生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量明顯提高，但當(dāng)氨基酸產(chǎn)量達(dá)到一定值后繼續(xù)增加時(shí)，菌絲體生物量及蟲(chóng)草素產(chǎn)量則有下降趨勢(shì)，這可能是由于細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝需要一定的C/N比，而氨基酸作為有機(jī)氮源，影響了這一比值，此問(wèn)題需進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)僅是添加技術(shù)的初步實(shí)驗(yàn)，在本實(shí)驗(yàn)中僅研究了氨基酸種類(lèi)、氨基酸添加量、初始pH值和培養(yǎng)溫度這4個(gè)因素，還有很多其他因素如培養(yǎng)基成分、裝樣量、通氣量等因素都有可能對(duì)發(fā)酵過(guò)程及結(jié)果產(chǎn)生重要影響。以前實(shí)驗(yàn)中對(duì)添加硒對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體生長(zhǎng)和蟲(chóng)草素含量的影響進(jìn)行了研究[26-27]，在以后的實(shí)驗(yàn)中，還要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)找出更加優(yōu)化的培養(yǎng)條件。

本研究?jī)H對(duì)影響蛹蟲(chóng)草菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量最為顯著的3種堿性氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)研究。在后續(xù)研究還將對(duì)包含其他17種氨基酸的所有氨基酸以及它們之間的相互作用進(jìn)行研究分析。

蛹蟲(chóng)草的活性有效成分除蟲(chóng)草素外，還包括蟲(chóng)草多糖和蟲(chóng)草酸等，二者也具有很大的藥用價(jià)值和保健功效。本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)添加氨基酸后對(duì)蟲(chóng)草素含量的影響進(jìn)行了考察，在以后的實(shí)驗(yàn)中將對(duì)蟲(chóng)草多糖和蟲(chóng)草酸進(jìn)行考察，更全面系統(tǒng)的掌握添加氨基酸對(duì)蛹蟲(chóng)草有效成分的影響，找到最佳培養(yǎng)條件。

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Amino Acid Addition Technology during Mycelium Fermentation ofCordyceps militaris

BEN Song-bin1，LI Hui-jiao2，HUANG Zi-qi1，SANG Yu-li2，MENG Cheng-cheng1，HOU Xiao1，MU Teng1，CHEN Chang-lan2,*
(1. School of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China；2. School of Pharmaceutical Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Histidine, arginine and lysine are alkaline amino acids that have an important effect on the growth ofCordyceps militaris. In this study, the effects of amino acid addition under various conditions on the growth of mycelium and the production of cordycepin as an anti-cancer functional ingredient during the fermentation process was investigated. Single factor experiments confirmed that the order of factors to affect the growth of mycelium during fermentation process from strong to weak was amino acid type, fermentation temperature, initial pH and amino acid amount. The optimal fermentation conditions for the growth of mycelium were explored by orthogonal experiments to be lysine as the selected amino acid, fermentation temperature of 26 ℃,initial pH of 6 and lysine amount of 0.3 g in 100 mL of medium. Similarly, single factor experiments confirmed that the order of factors to affect the production of cordycepin during fermentation process from strong to weak was amino acid type, initial pH,fermentation temperature and amino acid amount. The optimal fermentation conditions for the production of cordycepin were achieved by orthogonal experiments to be arginine as the selected amino acid, initial pH of 6, fermentation temperature of 24 ℃and arginine amount of 0.3 g in 100 mL of medium.

Cordyceps militaris；cordycepin；amino acid；addition technology

S567.35；TQ266.1

A

1002-6630(2010)23-0233-05

2010-06-30

遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2009S046)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671176)；遼寧大學(xué)校級(jí)三期“211工程”項(xiàng)目；沈陽(yáng)市人才資源開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)(2008040403035)

賁松彬(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)。E-mail：bensongbin007@163.com

*通信作者：陳長(zhǎng)蘭(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檫z傳學(xué)。E-mail：chenchanglanbio@yahoo.com.cn