海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas flavipulchraHH407產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)研究

呂明生，王淑軍,*，李華鐘，李 丹1,，陳 麗，房耀維

(1.淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222001)

海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas flavipulchraHH407產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的發(fā)酵條件和
酶學(xué)性質(zhì)研究

呂明生1,3，王淑軍1,3,*，李華鐘2，李 丹1,2，陳 麗3，房耀維1,3

(1.淮海工學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222001)

對一株分離自連云港海域的海洋細(xì)菌(Pseudoalteromonas flavipulchraHH407)菌株產(chǎn)蛋白酶的條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在發(fā)酵溫度為20℃、培養(yǎng)基pH值為8.0、NaCl質(zhì)量濃度為20g/L、接種量2.5%和裝液量20%時產(chǎn)酶較高。甘露醇、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、魚粉和酵母粉有利于蛋白酶的產(chǎn)生。該酶的最適作用溫度為35℃，0℃時相對酶活力達(dá)21.7%。45℃條件下保溫60min后酶活力仍能保持80%以上。酶的最適作用pH值為10.0，pH值為7.0～11.0范圍為時，酶活力相對比較高。酶在pH8.0～11.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，最穩(wěn)定的pH值為10.0，屬于低溫堿性蛋白酶，Mn2+、Cu2+、Ca2+對其具有較強(qiáng)的激活作用，Hg2+較強(qiáng)地抑制其酶活力。苯甲基磺酰氟(PMSF)能完全抑制該蛋白酶，EDTA無影響表明該酶屬于絲氨酸蛋白酶。

Pseudoalteromonas flavipulchraHH407；低溫蛋白酶；酶學(xué)性質(zhì)；產(chǎn)酶條件

Abstract：The optimal fermentation conditions for producing low-temperature alkaline protease by a marine bacterium(Pseudoalteromonas flavipulchraHH407) from Lianyungang sea area and some enzymatic properties of this enzyme are reported in this article. The highest enzyme production was achieved at the conditions of fermentation temperature of 20 ℃, pH 8.0,NaCl concentration of 20 g/L, inoculum amount of 2.5% and medium volume in fermentation tank of 20%. Meanwhile, enzyme production was improved by adding mannitol, fructose, lactose, sucrose, maltose, fishmeal and yeast extract. The optimal reaction temperature for this protease was 35 ℃. The relative enzyme activity was 21.7% at 0 ℃ and 80% after incubation at 45 ℃ for 60 min. The optimal pH for this protease was pH 10.0. A high level of relative activity could be remained in the pH range of 7.0 to 11.0. This protease was stable in the range of pH 8.0 to 11.0. Therefore, it is a low-temperature alkaline protease.Moreover, its activity was stimulated in the presence of Mn2+, Cu2+and Ca2+, and inhibited in the presence of Hg2+and PMSF,but was not affected by EDTA. These investigations suggest that this protease might be a serine protease.

Key words：Pseudoalteromonas flavipulchraHH407；low-temperature protease；enzymatic property；protease production condition

低溫酶(cold temperature-enzyme)是指在低溫條件下能有效催化生化反應(yīng)的一類酶，最適反應(yīng)溫度比普通酶要低20～30℃，而且在0℃有一定的活性[1]。低溫酶促作用溫度低，在不加熱的情況下就可以保證較高的催化效率。另外，在生產(chǎn)中由于低溫淀粉酶對熱敏感，所以通過較低溫度的熱處理就可以使酶失活，節(jié)約了能源。低溫蛋白酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及醫(yī)療方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可廣泛應(yīng)用于釀造、啤酒生產(chǎn)、乳酪制造、肉類加工、飼料、醫(yī)藥、洗滌清潔劑、化妝品、紡織及環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域。

低溫蛋白酶多由低溫生態(tài)環(huán)境如海水、海底沉積物、冰川、高山、南北極的低溫菌產(chǎn)生，隨著陸地資源的不斷開發(fā)而面臨枯竭，近年來人們逐漸將海洋微生物作為獲得低溫蛋白酶的新來源。目前從海洋篩選得到的低溫蛋白酶產(chǎn)生菌主要為黃桿菌屬(Flavobacterium)[2]、假單胞菌屬(Pseudomonas)[3]、弧菌屬(Vibrio)[4]、海桿菌屬(Marinobacter)[5]、交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)[6-7]。

本課題組從連云港海域篩選得到一株海洋細(xì)菌交替假單胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchraHH407)，該菌最適生長溫度為20℃，能在0℃條件下緩慢生長，15～25℃條件下生長較好，40℃及以上不生長；該菌生長pH值范圍為5.5～11.0，最適生長pH值為8.5，是低溫嗜堿菌[8]。交替假單胞菌(又稱假交替單胞菌)僅分布于海洋環(huán)境中，目前在世界范圍海洋中，包括南極洲嚴(yán)寒海洋環(huán)境中分離到多株交替假單胞菌，已經(jīng)鑒定到種的有P. tunicata、P. agarolytic和P. bacteriolytica等32種，每年都有1～2個新種發(fā)現(xiàn)。Pseudoalteromonas flavipulchra是2002年報(bào)道新分類的種[9-10]，目前尚未見該菌產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的報(bào)道。本課題組研究發(fā)現(xiàn)該菌能產(chǎn)生低溫蛋白酶[8]，本實(shí)驗(yàn)主要對該菌產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件及該酶的性質(zhì)進(jìn)行研究，為低溫蛋白酶的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

一株分離自連云港海域的海洋細(xì)菌P. flavipulchraHH407[8]由淮海工學(xué)院海洋微生物研究室分離和保藏。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5、酵母粉3、葡萄糖5，陳海水配制，pH8.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10、乳糖5、Triton X-1000.4、CaCl20.1，陳海水配制，pH8.0?；九囵B(yǎng)基(g/L)：酵母粉10、乳糖5、陳海水配制，pH8.0。人工海水(g/L)：VOSO4·2H2O 0.005、LiCl 0.05、H3BO30.1、NiCl2·6H2O 0.01、BaCl2·2H2O 0.005、CuSO4·5H2O 0.01、ZnSO4·7H2O 0.1、CoCl2·6H2O 0.005、MnCl2·4H2O 0.2、Na2MoO4·2H2O 0.1、KBr 0.05、KI 0.05、NaF 0.05、Al2(SO4)30.05、H2WO40.005、SrCl2·6H2O 0.005。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BS323S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-2C型精密酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠；DIRECT-Q3純水系統(tǒng) Millipore公司；Biotek synergy HT酶標(biāo)儀 美國Biotek公司；Christ冷凍干燥機(jī) 德國Martin公司；CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本Hitach公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酶發(fā)酵方法

將海洋細(xì)菌HH407接入種子培養(yǎng)基，20℃、180r/min，振蕩培養(yǎng)18h。將種子液按2%接種量接入含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在20℃，180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)30h。

1.3.2 產(chǎn)酶條件的研究

1.3.2.1 發(fā)酵時間和溫度對產(chǎn)酶的影響

將菌株2%接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在不同溫度(5、10、15、20、25、30℃)條件下180r/min振蕩培養(yǎng)不同時間，每隔一定時間測定菌體生物量和酶活力。

1.3.2.2 培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)基NaCl質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入下列不同的緩沖液(10mmol/L)：pH5.0～6.0(MES緩沖液)、pH7.0(PIPES緩沖液)、pH7.5～8.5(HEPES 緩沖液)、pH9.0～12.0(Tris-HCl緩沖液)，使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別為6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0)于20℃、180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)30h，測酶活力。用人工海水配制不同質(zhì)量濃度的NaCl發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測定酶活力。

對于發(fā)育正常的青少年來說，亦不可掉以輕心，平時應(yīng)注意保證充足的睡眠，少熬夜，加強(qiáng)體格鍛煉與戶外陽光照射等，同時要特別注意營養(yǎng)均衡，合理飲食，不挑食，這樣才能保證身體健康成長。

1.3.2.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

菌株接種量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%，進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測定酶活力。

1.3.2.4 不同碳氮源對產(chǎn)酶的影響

去除發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳糖，分別在培養(yǎng)基加入終質(zhì)量濃度為1g/100mL的各種碳源(分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇和檸檬酸)進(jìn)行碳源對產(chǎn)酶的影響的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。去除發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉，分別加入終質(zhì)量濃度為1g/100mL的各類氮源(分別為魚粉、酵母粉、硫酸銨、酪蛋白和豆餅粉)進(jìn)行氮源對產(chǎn)酶影響的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測酶活力。

1.3.2.5 表面活性劑和金屬離子對產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.04g/100mL不同的表面活性劑，進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.04g/100mL的不同金屬離子，進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分別測定酶活力。

1.3.3 酶的純化

選擇60%硫酸銨飽和度的鹽析透析液，通過快速蛋白純化系統(tǒng)(FPLC，Bio-Rad，USA)采用DEAE、丁基疏水層析和丙烯葡聚糖凝膠S-200層析等各種層析柱對酶進(jìn)行分離純化[11]。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.3.4.1 溫度對酶活性和穩(wěn)定性的影響

將酶分別在0～70℃范圍內(nèi)每隔5℃測定酶活力。把酶液分別在25、35、45、55、65℃保溫不同的時間，然后在35℃條件下測定殘余酶活力，以未處理酶液的酶活力設(shè)為100%。

1.3.4.2 pH值對酶活力和穩(wěn)定性的影響

將酶液在不同pH值的酪蛋白溶液中35℃條件下進(jìn)行酶活力測定，不同pH值的緩沖液為：50mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0～5.0)；50mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.0～6.0)；50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.0～7.5)；50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5～9.0)；50mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.5～11.0)；50mmol/L磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH11.0～12.0)。用不同pH值的緩沖液稀釋酶液，35℃保溫30min后，取出測定殘余酶活力，將未處理酶液的酶活力設(shè)為100%。

1.3.4.3 金屬離子和各種化學(xué)試劑對酶的作用

將各種金屬離子與酶液混合，使其最終濃度達(dá)到2.0、5.0mmol/L，然后在35℃條件下測酶活力，以不加金屬離子的為對照。將各種抑制劑與酶液混合，使抑制劑最終濃度分別為5.0mmol/L和10.0mmol/L，35℃保溫30min后，以不加抑制劑的酶活力設(shè)為100%。將有機(jī)溶劑、表面活性劑、變性劑等分別與酶液混合，35℃保溫30min后，以不加各試劑的酶活力設(shè)為100%。

1.3.5 蛋白酶活力測定

采用Folin顯色法測定，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%酪蛋白的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(100mmol/L，pH10.0)為底物，在35℃、pH10.0的條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶條件的研究

2.1.1 溫度對菌株生長和所產(chǎn)酶活力的影響

圖1 溫度對菌株HH407生長和所產(chǎn)酶活力的影響Fig.1 Effect of culture temperature on the growth of strain HH407 and alkaline protease production

如圖1所示，菌株P(guān). flavipulchraHH407能在5～30℃條件下生長，最適生長溫度為20℃，屬于低溫菌[8]，因此重點(diǎn)研究了5～30℃對菌株生長和產(chǎn)酶的影響，該菌株在5、10、15℃時生長較為緩慢，延滯期較長，生物量較少，蛋白酶的合成速率也較低。隨著溫度的升高，在高于20℃時，延滯期顯著縮短，生長速率加快，酶合成速率也加快。在培養(yǎng)溫度達(dá)到20℃時產(chǎn)酶達(dá)到高峰時間短且酶活力較高。當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到25℃后，菌株生長速率更快，產(chǎn)酶達(dá)到高峰時間短但酶活力較20℃低，且隨著時間的延長酶活逐漸損失，溫度越高，酶活力損失越多，說明該蛋白酶對熱比較敏感，熱穩(wěn)定性較差。該菌株最適產(chǎn)酶溫度為20℃，與菌株最適生長溫度一致。

2.1.2 培養(yǎng)基pH值、NaCl質(zhì)量濃度和菌株接種量對菌株產(chǎn)酶的影響

圖2 pH值、NaCl質(zhì)量濃度和接種量對菌株HH407產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of pH, NaCl concentration and inoculum amount on alkaline protease production

如圖2A所示，菌株P(guān). flavipulchraHH407生長pH值范圍為5.5～11.0，最適生長pH值為8.5，屬于嗜堿菌[8]，因此重點(diǎn)研究了pH6～12對菌株產(chǎn)酶的影響，所示菌株HH407最適產(chǎn)酶pH值為8.0，產(chǎn)酶pH值的范圍均較寬，pH6.0和pH11.0仍能產(chǎn)酶。菌株HH407的產(chǎn)酶受NaCl質(zhì)量濃度的影響較大，其產(chǎn)酶最適質(zhì)量濃度為20g/L，15～50g/L NaCl時酶活力均較高，無NaCl不產(chǎn)酶(圖2B)。菌株HH407產(chǎn)酶隨接種量0.5%～2.5%增加而升高，2.5%接種量時酶活力最高，3%～4%接種量時酶活力又有下降趨勢(圖2C)。

2.1.3 碳、氮源對菌株產(chǎn)酶的影響

表1 碳氮源對菌株HH407產(chǎn)酶的影響Table 1 Effects of types of carbon and nitrogen sources on alkaline protease production

從表1可以看出，不同的碳源對此菌株蛋白酶的產(chǎn)量有影響。甘露醇、果糖、乳糖、蔗糖和麥芽糖對菌株發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶有促進(jìn)作用，而甘油、淀粉、檸檬酸等對酶活促進(jìn)不明顯。發(fā)酵培養(yǎng)基氮源添加魚粉的酶活力最高，其次為酵母粉和酪蛋白，添加氯化銨不產(chǎn)酶，說明該菌株能利用營養(yǎng)物質(zhì)豐富的有機(jī)氮源，所以有機(jī)氮源是蛋白酶合成必需的，而對其他氮源的利用能力都較差。

2.1.4 金屬離子和表面活性劑對菌株產(chǎn)酶的影響

表2 金屬離子和表面活性劑對菌株產(chǎn)酶的影響Table 2 Effects of metal ions and surfactants on alkaline protease production

從表2可以看出，Ca2+、Mn2+、K+對產(chǎn)酶促進(jìn)比較明顯。K+是許多酶的激活劑，適量的Mn2+能促進(jìn)細(xì)胞的生長和酶的生成，而Ca2+是蛋白酶的穩(wěn)定劑。Mg2+無明顯影響，其余離子對酶均有抑制作用。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.04g/100mL不同的表面活性劑，這3種表面活性劑均能促進(jìn)產(chǎn)酶，其中曲通X-100促進(jìn)最明顯。表面活性劑對蛋白酶的穩(wěn)定性有保護(hù)作用。

2.2 酶的純化

表3 蛋白酶的分離純化Table 3 A summary of isolation and purification procedures of alkaline protease

從表3可以看出，對菌株HH407產(chǎn)生的蛋白酶通過硫酸銨鹽析、DEAE離子交換層析、丁基疏水層析、葡聚糖凝膠層析進(jìn)行了純化，純化后，酶比活力由37.5U/mg提高到609.3U/mg，提高了16.24倍。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 酶的作用溫度和熱穩(wěn)定性

圖3 酶作用溫度對蛋白酶活力(A)及穩(wěn)定性(B)的影響Fig.3 Effect of temperature on activity and stability of alkaline protease

由圖3A可知，該酶最適作用溫度為35℃，在30～40℃溫度范圍時有較高的催化活力，在0℃時依然有21.7%的相對酶活力。由圖3B可知，酶的熱穩(wěn)定性在較低的溫度范圍內(nèi)較好，如在45℃條件下保溫60min后酶活仍能保持80%以上。Dixit等[10]從南極洲分離得到Clostridiumsp.，所產(chǎn)低溫蛋白酶最適溫度為37℃，40℃保溫30min仍有80%的酶活力。菌株HH407產(chǎn)生的蛋白酶比Clostridiumsp.產(chǎn)生的蛋白酶作用溫度低，耐熱性較好。由于低溫酶一般為低溫菌所產(chǎn)生，酶合成溫度低，最適酶活溫度低，熱穩(wěn)定性差等特征，HH407菌所產(chǎn)的蛋白酶符合低溫酶的特點(diǎn)[12-13]。

2.3.2 酶的作用pH值和pH值穩(wěn)定性

圖4 pH值對酶活力的影響(A)和酶的pH值穩(wěn)定性(B)Fig.4 Effect of pH on activity and stability of alkaline protease

由圖4A可知，酶的最適pH值受緩沖系統(tǒng)的影響，該蛋白酶的最適作用pH值為10.0，且在pH值范圍為7.0～11.0時，相對酶活力比較高，pH12.0仍有40.8%的酶活力，表明該菌所產(chǎn)蛋白酶為堿性蛋白酶。由圖4B可知，該堿性蛋白酶在pH8.0～11.0有較好的穩(wěn)定性，殘余酶活力保持在80%以上，屬于堿性蛋白酶的范疇[14-15]。

2.3.3 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活性的影響

從表4可以看出，Mn2+、Cu2+、Sr2+和Ca2+對酶有一定激活作用，其中以Mn2+、Cu2+最為明顯，Ag+、Na+、Mg2+、Pb2+對酶活力作用不明顯，Hg2+能較強(qiáng)抑制酶活力，其余離子均有抑制作用。

表4 金屬離子對蛋白酶活性的影響Table 4 Effect of metal ions on alkaline protease activity

表5 化學(xué)試劑對蛋白酶活性的影響Table 5 Effect of chemical reagents on alkaline protease activity

從表5可以看出，EDTA和IAA對酶活有稍微的激活作用，而PMSF對此蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，推測該酶可能是一種絲氨酸蛋白酶。堿性蛋白酶最大的用途是作為加酶洗滌劑，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一些有機(jī)溶劑、表面活性劑、變性劑等化學(xué)試劑對酶活力的影響。該堿性蛋白酶具有較強(qiáng)的耐受性，2mol/L尿素提高該堿性蛋白酶的酶活[7]，1%吐溫-20和1%吐溫-80以及1%過氧化氫能促進(jìn)蛋白酶酶活，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。

3 結(jié) 論

對連云港海域海洋細(xì)菌菌株P(guān)seudoalteromonas flavipulchraHH407產(chǎn)蛋白酶的條件進(jìn)行研究表明，在發(fā)酵溫度為20℃、培養(yǎng)基pH值為8.0、NaCl質(zhì)量濃度為20g/L、接種量為2.5%和裝液量為20%時產(chǎn)酶較高。該酶的最適作用溫度為35℃，0℃時相對酶活力達(dá)21.7%。該酶的最適作用pH值為10.0，在pH值為8.0～11.0穩(wěn)定，表明該酶屬于低溫堿性蛋白酶。Mn2+、Cu2+、Ca2+具有較強(qiáng)的激活作用，Hg2+較強(qiáng)抑制酶活力。PMSF能完全抑制該蛋白酶，EDTA無影響表明該酶屬于絲氨酸蛋白酶。菌株HH407所產(chǎn)蛋白酶可以在低溫進(jìn)行催化，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

[1] CAVICCHIOLI R, SIDDIQUI K S, ANDREW D, et al. Low temperature extremophiles and their applications[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13:253-261.

[2] 張?jiān)撇? 孫謐, 洪義國, 等. 產(chǎn)低溫堿性蛋白酶黃海黃桿菌YS-9412-130高產(chǎn)菌株的選育[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2000, 21(4):14-19.

[3] 馮靜, 荊谷, 謝慧君, 等. 海洋細(xì)菌Pseudomonassp.7-11產(chǎn)堿性蛋白酶的研究[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版, 2002, 37(3):264-267.

[4] 劉成圣, 劉晨光, 劉萬順, 等. 海洋弧菌堿性蛋白酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2002, 32(5):734-740.

[5] 林念煒, 張銳, 趙晶, 等. 南極產(chǎn)低溫蛋白酶菌株Marinobactersp.R2的發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2004,43(6):865-869.

[6] 李建偉, 潘軍, 何海倫, 等. 深海適冷假交替單孢菌Pseudoaltermonassp. SM9913產(chǎn)適冷蛋白酶的條件優(yōu)化[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版,2004, 39(4):104-108.

[7] 曾胤新, 俞勇, 李會榮, 等. 北極海洋細(xì)菌BSw20353的胞外蛋白酶性質(zhì)[J]. 極地研究, 2006, 18(3):206-214.

[8] 李丹, 陳麗, 李富超, 等. 一株海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas flavipulchraHH407產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的篩選與生長特性的研究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 26(6):74-80.

[9] IVANOVAE P, SHEVCHENKO L S, SAWABE T, et al.Pseudoalteromonas maricalorissp. Nov., isolated from an Austalian sponge, and reclassification of [Pseudoalteromonas aurantia] NCIMB2033 asPseudoalteromonas flavipulchrasp. Nov.[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002, 57:263-271.

[10] DIXIT A, ALAM S I, SINGH L. Sequencing and phylogenetic analysis of neurotoxin gene from an environmental isolate ofClostridiumsp.:comparison with other clostridial neurotoxins[J]. Archives of Toxicology,2006, 80(7):399-404.

[11] 王宇婧, 張曼平, 孫謐, 等. YS-80-122海洋低溫堿性蛋白酶的性質(zhì)[J]. 海洋湖沼通報(bào), 2004(1):8-15.

[12] GERDAY C, AITTALEB M, BENTAHIR M, et al. Cold-adapted enzymes:from fundamentals to biotechnology[J]. Trends in Biotechnology, 2000, 18:103-107.

[13] ANDREY G, LJUDMILA K, TORU N, et al. Cold-active enzymes from cold-adapted microorganisms:Their possible applications and structural relationships with mesophilic and thermophilic counterparts[J]. Recent Advances in Marin Biotechnology, 2003, 43:1-27.

[14] ELLAIAH P, SRINIVASULU B, ADINARAYANA K. A review on microbial alkaline protease[J]. Science Ind Research, 2004, 61:690-704.

[15] ELIBOL M, MOREIRA A R. Optimizing some factors affecting alkaline protease production by a marine bacteriumTeredinobacter turniraeunder solid substrate fermentation[J]. Process Biochemstry, 2005, 40:1951-1956.

Fermentation Conditions for the Production of Low-temperature Alkaline Protease byPseudoalteromonas flavipulchraHH407 and Its Enzymatic Properties

TS275.4

A

1002-6630(2010)21-0298-06

2010-06-08

江蘇省科技廳工業(yè)支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2009095)

呂明生(1963—)，男，副教授，本科，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：mingshenglu@hotmail.com

*通信作者：王淑軍(1965—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：shujunwang86@hotmail.com