丁香、甘草協(xié)同抑菌作用研究

張雁南，寧志亮，陳長(zhǎng)武，王大為*

(1.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130052；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

丁香、甘草協(xié)同抑菌作用研究

張雁南1，寧志亮1，陳長(zhǎng)武1，王大為2,*

(1.吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130052；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

對(duì)丁香、甘草、八角、白芷、草蔻和胡椒6種常用香辛料提取液的抑菌作用進(jìn)行研究，選擇抑菌作用較強(qiáng)的香辛料提取液進(jìn)行協(xié)同抑菌作用研究，確定協(xié)同作用的最佳配比。結(jié)果表明：丁香和甘草提取液抑菌作用較強(qiáng)，丁香與甘草提取液的最佳配比為體積比5:3，協(xié)同抑菌作用大于單一提取液。研究了復(fù)配液的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)，對(duì)細(xì)菌的MIC為3.125mg/mL，對(duì)霉菌的MIC為6.25mg/mL，在較低質(zhì)量濃度下即可達(dá)到較好的抑菌效果。

香辛料；丁香；甘草；抑菌作用；協(xié)同作用

Abstract：The inhibitory effects of ethanol extracts from six commonly used spices on five species of microorganisms were measured and compared in order to screen spices with higher antimicrobial activity, and the optimal mixing ratio for screened spices resulting in the best synergistic antimicrobial effect was determined. Clove and licorice were the selected spices based on the results from the comparison of antimicrobial activity, and the best mixing ratio for the ethanol extracts from them was 5:3(V/V), which gave a synergistic antimicrobial effect better than single uses of them. The mixture presented minimum inhibitory concentrations (MIC) of 3.125 mg/mL for bacteria and 6.25 mg/mL for mold and could show better antimicrobial effect at a low concentration.

Key words：spices；clove；licorice；antimicrobial activity；synergistic effect

香辛料一般指具有食用安全性的芳香植物的根、樹(shù)皮、種子或果實(shí)，具有調(diào)味增香的作用，大多數(shù)香辛料具有抑菌防腐作用和抗氧化作用[1-2]，某些品種如豆蔻、丁香、枸杞等還是藥食兼用的名貴原料，香辛料已經(jīng)成為天然食品防腐劑的重要來(lái)源。目前關(guān)于植物香辛料抑菌作用的報(bào)道多集中在單獨(dú)使用時(shí)的抗菌效果，關(guān)于協(xié)同抑菌效應(yīng)的報(bào)道較少，而丁香、甘草協(xié)同抑菌作用還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究選擇丁香、甘草、八角等6種常用香辛料，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉等5種微生物為供試菌，考察了6種香辛料提取液的抑菌效果，選擇抑菌作用較強(qiáng)的丁香和甘草進(jìn)行協(xié)同抑菌作用研究，確定提取液的最佳配比，并測(cè)定復(fù)配液的最低抑菌濃度，以期為香辛料天然食品防腐劑的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香、甘草、八角、白胡椒、白芷、草蔻為市售優(yōu)級(jí)品，無(wú)霉變、無(wú)蟲(chóng)蛀、干燥、形態(tài)完整。

青霉(Penicilliumsp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli) 吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無(wú)水乙醇、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉、氫氧化鈉、蔗糖(均為分析純) 北京化工廠。

分別配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(培養(yǎng)細(xì)菌用)和查氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)霉菌用)[3]，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-S型水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 西安太康生物科技有限公司；LRH-250-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；DRH-100型電熱恒溫箱 廣東省環(huán)境保護(hù)儀器設(shè)備廠；LDZX-40Ⅱ型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；單人垂直凈化工作臺(tái) 蘇州三興凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌物質(zhì)的提取

原料干燥后，粉碎至可全部通過(guò)孔徑為0.420mm的標(biāo)準(zhǔn)篩。提取方法根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液，料液比1:10(m/V)，提取溫度60℃，浸提2h，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，制備質(zhì)量濃度為1g/mL的提取液。

1.3.2 菌懸液的制備[4]

將各供試菌在各自的培養(yǎng)基上活化后，分別用滅菌生理鹽水配制成含菌數(shù)106～107個(gè)/mL的菌懸液備用。一般挑選大小適中的菌落2個(gè)，無(wú)菌操作加入9mL無(wú)菌生理鹽水中、混勻。

1.3.3 抑菌效果的測(cè)定

采用濾紙片法[5-6]。用打孔器將定性濾紙加工成直徑6mm的圓形濾紙片，干熱滅菌，取無(wú)菌濾紙片放入各提取液中浸泡1h，取出、晾干。將各供試菌懸液取0.2mL滴到凝固好的無(wú)菌平板上，涂布均勻，放置1h，將上述含提取液且已干燥的濾紙片貼在含菌平板上，每個(gè)平板內(nèi)等距離貼3片，以體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液浸泡的濾紙片作為對(duì)照，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌37℃培養(yǎng)24h，霉菌28℃培養(yǎng)48h。提取液和對(duì)照均設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)量抑菌圈直徑大小，取其平均值，以抑菌圈直徑為指標(biāo)評(píng)價(jià)提取液的抑菌效果。

1.3.4 提取液的協(xié)同抑菌實(shí)驗(yàn)

考慮到香辛料提取液應(yīng)用于食品的防腐保鮮，提取液不能影響食品本來(lái)的色澤、氣味，因此選擇抑菌效果較強(qiáng)、氣味較輕、顏色較淺的香辛料提取液進(jìn)行復(fù)配，考察協(xié)同抑菌效果，測(cè)定方法同1.3.3節(jié)。

1.3.5 復(fù)配液最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測(cè)定

采用二倍稀釋法[7]：將復(fù)配液用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行倍比稀釋，其系列質(zhì)量濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563mg/mL。用無(wú)菌吸管分別吸取2mL稀釋液加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后每皿倒入15～20mL已滅菌并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基，充分混勻，制成含樣品平板。每平板加入0.2mL菌懸液，涂勻，培養(yǎng)，以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度為復(fù)配液的最低抑菌質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香辛料提取液的抑菌作用

將丁香、甘草、八角等如1.3.1節(jié)制備提取液，如1.3.3節(jié)考察各提取液對(duì)大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉的抑菌效果。

表1 不同香辛料提取物對(duì)供試菌的抑制作用Table1 Comparison of antimicrobial effects of ethanol extracts from six commonly used spices on five species of microorganisms mm

由表1可看出，各提取液都對(duì)供試菌都表現(xiàn)出了一定的抑制作用，其中丁香、甘草、八角提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、青霉的抑制作用較強(qiáng)；丁香、八角提取液對(duì)黑曲霉的抑制作用明顯優(yōu)于甘草、胡椒、草蔻等提取液；胡椒、白芷提取液對(duì)霉菌的抑制作用優(yōu)于其對(duì)細(xì)菌的抑制作用。綜合考慮，丁香、甘草、八角提取液的抑菌作用較強(qiáng)，其中丁香提取液的抑菌作用最強(qiáng)。

2.2 丁香、甘草提取液的協(xié)同抑菌作用

由于八角提取液的氣味較重，選擇丁香和甘草提取液按照表2進(jìn)行復(fù)配，考察其協(xié)同抑菌作用。復(fù)配液的抑菌效果見(jiàn)表3。

表2 丁香和甘草提取液復(fù)配方案Table 2 Mixing ratios for ethanol extracts from clove and licorice

表3 復(fù)配液對(duì)供試菌的抑制作用Table 3 Antimicrobial effects of ethanol extracts from clove and licorice mixed in different ratios mm

由表3可看出，兩種提取液混合后，隨著二者體積比的不同，抑菌成分之間既有協(xié)同增效作用，使復(fù)配液對(duì)某些供試菌的抑菌效果高于單一提取液；又有拮抗作用，使復(fù)配液對(duì)某些供試菌的抑菌效果低于單一提取液。丁香、甘草提取液中有效成分較為復(fù)雜，相互之間的反應(yīng)機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。 對(duì)表3中各處理組的抑菌性能進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表4～8。

表4 復(fù)配液對(duì)大腸桿菌抑制作用的差異顯著性分析Table 4 Significance of difference in anti-E. colieffects of ethanol extracts from clove and licorice mixed in different ratios

表5 復(fù)配液對(duì)枯草芽孢桿菌抑制作用的差異顯著性分析Table 5 Significance of difference in anti-Bacillus subtiliseffects of ethanol extracts from clove and licorice mixed in different ratios

表6 復(fù)配液對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌抑制作用的差異顯著性分析Table 6 Significance of difference in anti-Salmonella typhimuriumeffects of ethanol extracts from clove and licorice mixed in different ratios

表7 復(fù)配液對(duì)青霉抑制作用的差異顯著性分析Table 7 Significance of difference in anti-Penicilliumsp. effects of ethanol extracts from clove and licorice mixed in different ratios

表8 復(fù)配液對(duì)黑曲霉抑制作用的差異顯著性分析Table 8 Significance of difference in anti-Aspergillus nigereffects of ethanol extracts from clove and licorice mixed in different ratios

從表4～8可看出，處理號(hào)7對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、黑曲霉的抑制作用最強(qiáng)，與其他處理號(hào)存在顯著性差異。從表7可看出，處理號(hào)6、7對(duì)青霉的抑制作用與其他處理號(hào)存在顯著性差異，處理號(hào)6、7之間也存在顯著性差異，但二者對(duì)青霉都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。與單一提取液比較，處理號(hào)7對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于丁香提取液，稍弱于甘草提取液，對(duì)霉菌的抑制作用強(qiáng)于單一提取液。處理號(hào)7的抑菌圈直徑總和103.27mm，均值20.65mm，高于單一提取液和其他處理號(hào)。綜合考慮，選擇處理號(hào)7的比例作為復(fù)配液的最佳配比。同時(shí)，處理號(hào)7的抑菌效果高于張百剛等[8]、錢昆等[9]、汪生等[10]的研究結(jié)果。

2.3 7號(hào)復(fù)配液最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

表9 復(fù)配液對(duì)供試菌MIC的測(cè)定Table 9 MICs of ethanol extracts from clove and licorice mixed in optimal ratio

由表9可看出，復(fù)配液在較低質(zhì)量濃度下對(duì)細(xì)菌和霉菌的抑制效果較好。不同質(zhì)量濃度的復(fù)配液對(duì)供試菌的抑制效果存在差異，原因可能是各種供試菌對(duì)同一抑菌成分的敏感程度不同。

3 結(jié) 論

3.1 對(duì)丁香、甘草、八角、白芷、草蔻、胡椒等6種常用香辛料提取液的抑菌作用進(jìn)行了研究，6種香辛料都有一定的抑菌作用，丁香提取液對(duì)細(xì)菌和霉菌都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用，甘草、八角提取液的抑菌作用優(yōu)于白芷、草蔻、胡椒提取液。

3.2 選擇抑菌作用強(qiáng)、氣味較輕的丁香、甘草提取液進(jìn)行復(fù)配，考察其協(xié)同抑菌作用。丁香與甘草提取液的體積比為5:3時(shí)協(xié)同抑菌作用最強(qiáng)，高于單一提取液，抑菌圈直徑總和達(dá)到為103.27mm，均值20.65mm。

3.3 7號(hào)復(fù)配液對(duì)細(xì)菌的MIC為3.125mg/mL，對(duì)霉菌的MIC為6.25mg/mL，說(shuō)明在較低質(zhì)量濃度下復(fù)配液的抑菌效果較好。

天然植物香辛料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，選出具有抑菌活性的香辛料并通過(guò)復(fù)配制備出高效、安全的復(fù)合保鮮劑將有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。香辛料提取液多有刺激氣味，直接添加到食品中對(duì)食品風(fēng)味有一定的影響，丁香和甘草成分之間存在著抗菌性的協(xié)同增效作用，在食品中聯(lián)合使用，可減少香辛料的用量，降低對(duì)食品風(fēng)味的影響，擴(kuò)大其使用范圍，也能降低成本。

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Synergistic Antimicrobial Effect of Ethanol Extracts from Clove and Licorice

ZHANG Yan-nan1，NING Zhi-liang1，CHEN Chang-wu1，WANG Da-wei2,*
(1.College of Food Engineering, Jilin Teachers’ Institute of Engineering and Technology, Changchun 130052, China；2.College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)21-0065-04

2010-09-02

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z336)

張雁南(1976—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)樘烊恢参锕δ艹煞痔崛〖笆称繁ｕr。E-mail：zhyn1221@163.com

*通信作者：王大為(1960—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂與植物蛋白工程及功能食品。E-mail：xcpyfzx@163.com