氯法拉濱注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

韓繼永，包曉莉，陳祥峰

（江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司，江蘇南京 211112）

氯法拉濱（clofarabine，商品名：Clolar）是第二代嘌呤核苷酸類似物，由美國Genzyme公司研發(fā)，2004年12月28日美國FDA快速審評并批準(zhǔn)其用于治療兒童難治性或復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL），患者此前至少已接受2種療法治療而無效者。作為目前唯一可以特異性用于兒童白血病的化療藥，其治療白血病總緩解率高，且耐受好，無不可預(yù)知的不良反應(yīng)[1-2]。氯法拉濱注射液作為靜脈注射用制劑，應(yīng)嚴(yán)格控制細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，目前尚無相關(guān)報道，本文參照相關(guān)藥品的內(nèi)毒素檢查法[3]，建立了采用鱟試劑測定氯法拉濱細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法，為建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提供了試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZH-2型自動漩渦混合器，天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠；DC-3A型細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干式恒溫器，南京三愛斯技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 試藥

鱟試劑（TAL，批號：0811242，靈敏度：0.125 EU/ml，規(guī)格：0.1 ml/支，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（TAL，批號：07030312，靈敏度：0.125 EU/ml，規(guī)格：0.1 ml/支，福州新北生物工業(yè)有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，批號：150601-200861，規(guī)格：150 EU/支，中國藥品生物制品檢定所）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號：200804，規(guī)格：10 ml/支，中國藥品生物制品檢定所）；氯法拉濱注射液（批號：070301，070302，070303；規(guī)格：20 ml∶20 mg，江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司藥物研究所）。整個試驗過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，所用器皿無熱原，保證無外源性物質(zhì)干擾[4-5]。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度的復(fù)核

按照《中國藥典》2005年版二部附錄ⅪE細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法操作[6]，用 BET 水將 CSE 稀釋制成 2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ系列濃度后進(jìn)行試驗，結(jié)果鱟試劑的復(fù)核靈敏度Cλ均為 0.5 λ～2.0 λ，符合規(guī)定。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式 L＝K/M，靜脈給藥時 K＝5 EU/（kg·h）。 本品用于兒童，兒科推薦劑量為52 mg/m2，2 h內(nèi)用完[7]，兒童年齡、體重跨度較大，按新生兒的體重為3 kg，體表面積為0.21 m2計算[8]，兒童的推薦劑量 M 為 1.82 mg/（kg·h）。 細(xì)菌內(nèi)毒素限值 L＝5[EU/（kg·h）]/1.82[mg/（kg·h）]＝2.75 EU/mg，為方便操作，將本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限度調(diào)整為每毫克氯法拉濱中含內(nèi)毒素的含量應(yīng)小于2.5 EU。

2.3 干擾試驗預(yù)試驗

根據(jù)最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/λ，c為氯法拉濱注射液濃度，為1.00 mg/ml，可計算出本品MVD為20倍，即最小有效檢測濃度為0.05 mg/ml。用BET水將氯法拉濱注射液稀釋成 0.50、0.40、0.20、0.10 和 0.05 mg/ml的溶液（記為 NPC管）；另制備同樣濃度系列的供試品溶液，并且每個濃度含2 λ的細(xì)菌內(nèi)毒素（記為PPC管）。取兩個不同廠家的鱟試劑若干，分別加0.1 ml BET水復(fù)溶，再分別加入各溶液0.1 ml，同時設(shè)陰性對照管（NC）和陽性對照管（PC），每管均平行2份，輕輕混勻，封口，在37℃保溫60 min，結(jié)果表明氯法拉濱注射液在濃度為0.05～0.50 mg/ml范圍內(nèi)，對試驗均無干擾，見表1。

表1 干擾試驗預(yù)試驗結(jié)果

2.4 正式干擾試驗

用BET水和0.5 mg/ml的供試品溶液，分別將同一支細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 2.00 λ、1.00 λ、0.50 λ、0.25 λ 4個濃度的溶液，再取鱟試劑36支，分別用0.1 ml BET水溶解后，加入各濃度稀釋液0.1 ml，每稀釋度做4管，同時做檢查用水陰性對照2管和樣品陰性對照2管，37℃保溫60 min后觀察，結(jié)果表明供試品在此濃度下，對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法無干擾作用，見表2。

2.5 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取供試品溶液，用BET水稀釋成0.5 mg/ml的供試品溶液，以靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑依法檢查，結(jié)果氯法拉濱注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果均小于2.5 EU/mg，見表3。

表2 干擾試驗結(jié)果

表3 氯法拉濱注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

通過干擾性預(yù)試驗篩選出不干擾鱟試劑與內(nèi)毒素凝聚反應(yīng)的氯法拉濱注射液濃度范圍，大大減少供試品檢驗時的盲目性。

采用0.5 mg/ml的供試品溶液進(jìn)行正式干擾試驗，結(jié)果表明 Es 為 0.5 λ～2.0 λ，且 Et在（0.5～2.0）Es，說明在此濃度下無干擾作用。

按兒童用藥劑量的3倍，作為熱原檢查時家兔的給藥劑量，即5.46 mg/kg，對3批氯法拉濱注射液進(jìn)行熱原檢查，結(jié)果均符合規(guī)定，表明內(nèi)毒素檢查和熱原檢查均可用于氯法拉濱注射液的質(zhì)量控制。由于凝膠法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素操作簡便，快速，因此建議質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用細(xì)菌內(nèi)毒素控制本品的質(zhì)量。

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[2]夏敏,蔣慧.兒童急性白血病治療新藥氯法拉濱[J].世界臨床藥物,2007,28(6):356-359.

[3]饒艷春,劉波.谷氨酸諾氟沙星注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊,2009,11(1):163-164.

[4]中國藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005附錄ⅪE:86-87.

[5]樊麗,趙金英.藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查經(jīng)驗總結(jié)[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2008,5(5):82-85.

[6]于娟,徐雪,畢麗華.凝膠法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)注意的問題[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2007,4(29):153-154.

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