表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO細(xì)胞動(dòng)態(tài)流加培養(yǎng)過(guò)程的設(shè)計(jì)

范里，趙亮，孫亞婷，寇天賜，譚文松

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO細(xì)胞動(dòng)態(tài)流加培養(yǎng)過(guò)程的設(shè)計(jì)

范里，趙亮，孫亞婷，寇天賜，譚文松

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

人腫瘤壞死因子受體Ⅱ-Fc融合蛋白在治療風(fēng)濕性、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面擁有廣闊的市場(chǎng)前景和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白的GS-CHO細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)代謝特性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析，以葡萄糖為關(guān)鍵控制參數(shù)，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)上清的葡萄糖濃度對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的葡萄糖消耗進(jìn)行及時(shí)的預(yù)測(cè)，調(diào)整流加速率，形成了以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)代謝需要為基本原則的動(dòng)態(tài)流加培養(yǎng)過(guò)程設(shè)計(jì)模型。在此控制模型指導(dǎo)下，建立了高效的流加培養(yǎng)過(guò)程。使最大活細(xì)胞密度和最大融合蛋白濃度分別達(dá)9.4×106cells/mL和207 mg/L，較批次培養(yǎng)分別提高了3.4倍和3倍。本研究所采用的研究方法和控制策略為優(yōu)化GS-CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程和TNFR-Fc融合蛋白成功邁向產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

GS-CHO細(xì)胞，流加培養(yǎng)，TNFR-Fc融合蛋白，葡萄糖，動(dòng)力學(xué)

Abstract:TNFR-Fc is an important fusion protein that has great potential in therapeutic and diagnostic applications.We developed an efficient fed-batch process for GS-CHO cells to produce TNFR-Fc.The rationale of this fed-batch process relies on the supply of sufficient nutrients to meet the requirements of cell metabolism.The optimal feed medium was designed through ration design.A metabolically responsive feeding strategy was designed and dynamically adjusted based on the residual glucose concentration determined off-line.In this process, the maximal viable cell density and antibody concentration reached above 9.4×106cells/mL and 207 mg/L, respectively.Compared with the batch process, the newly developed fed-batch process increased the cell yield by 3.4 fold and the final antibody concentration by 3 fold.This fed-batch process would therefore facilitate the production of therapeutic antibody by GS-CHO cells.

Keywords:GS-CHO cell, fed-batch, TNFR-Fc, glucose, dynamic model

隨著嵌合化、人源化和全人源化抗體融合蛋白藥物的設(shè)計(jì)技術(shù)的突破，抗體類(lèi)藥物成為生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。與微生物宿主相比，動(dòng)物細(xì)胞具有更完備的蛋白質(zhì)后期修飾及加工能力，因此利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)抗體類(lèi)藥物得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)的蛋白在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能方面最接近天然蛋白分子，因此成為生產(chǎn)抗體類(lèi)藥物的首選宿主細(xì)胞[1]。

人腫瘤壞死因子受體Ⅱ-Fc抗體融合蛋白(TNFR-Fc)是利用受體免疫球蛋白融合技術(shù)，將受體的細(xì)胞外區(qū)與人免疫球蛋白的 Fc段基因融合得到的重組蛋白。TNFR-Fc能夠特異性地與體內(nèi)腫瘤壞死因子結(jié)合，從而抑制關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。這類(lèi)藥物在治療風(fēng)濕性、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面具有明顯的療效，但是臨床使用劑量大和動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗體融合蛋白能力低的矛盾限制了其在臨床上的應(yīng)用。

流加培養(yǎng)由于其操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)，有利于產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性和過(guò)程成本的控制，因此廣泛用于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的生產(chǎn)，成為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的主流工藝[2]。然而流加培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物限制或抑制和有毒代謝物累積是限制細(xì)胞生長(zhǎng)和影響產(chǎn)物合成的主要因素[3-5]。已有許多文獻(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞的流加培養(yǎng)過(guò)程有所闡述[6-8]，但是一般只局限于恒速流加培養(yǎng)過(guò)程，其缺點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)加不平衡，利用率低。此外，針對(duì)表達(dá)TNFR-Fc的CHO細(xì)胞動(dòng)態(tài)流加培養(yǎng)過(guò)程也未見(jiàn)報(bào)道。因此針對(duì) GS-CHO細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)研究及在此基礎(chǔ)上流加培養(yǎng)過(guò)程的設(shè)計(jì)，是其成功邁向產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中一項(xiàng)必不可少的工作。

本研究通過(guò)測(cè)定分析細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(葡萄糖、丙酮酸、氨基酸和磷酸根)的需求，根據(jù)代謝動(dòng)力學(xué)分析，設(shè)計(jì)營(yíng)養(yǎng)均衡的流加培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的綜合利用效率；以葡萄糖為關(guān)鍵控制參數(shù)，通過(guò)離線測(cè)定培養(yǎng)上清中葡萄糖的濃度，對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的葡萄糖消耗進(jìn)行及時(shí)地預(yù)測(cè)，通過(guò)控制流加速率來(lái)補(bǔ)充細(xì)胞消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定；同時(shí)控制乳酸和滲透壓的累積，減緩對(duì)細(xì)胞的毒害。該流加培養(yǎng)過(guò)程有效地提高了細(xì)胞密度，延長(zhǎng)了培養(yǎng)周期，增加了融合蛋白的產(chǎn)量，為GS-CHO細(xì)胞培養(yǎng)和TNFR-Fc融合蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程優(yōu)化和放大奠定基礎(chǔ)。同時(shí)也將對(duì)其他動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程和重組蛋白藥物等產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為GS-CHO細(xì)胞，分泌人腫瘤壞死因子受體Ⅱ-Fc抗體融合蛋白。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Excell302 商業(yè)培養(yǎng)基(24324C，JRH公司)。流加培養(yǎng)基為葡萄糖、氨基酸、磷酸根、Pluronic F68等營(yíng)養(yǎng)成分的濃縮液，化學(xué)成分明確。各營(yíng)養(yǎng)物組分的濃度采用理性設(shè)計(jì)方法(Rational design)進(jìn)行設(shè)計(jì)[9-10](表1)。上述培養(yǎng)基均經(jīng)Millipore公司0.1 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。所有培養(yǎng)基配制所用試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

表1 流加培養(yǎng)基組成及添加物濃度Table 1 Supplementations made to the feed solution used in feed medium

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法

1.3.1 種子細(xì)胞培養(yǎng)

從細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇GS-CHO種子細(xì)胞，以2×105～3×105cells/mL活細(xì)胞密度接種于搖瓶，置于36.8℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為50 r/min，作為實(shí)驗(yàn)用的種子細(xì)胞。

1.3.2 反應(yīng)器中的批次培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GS-CHO細(xì)胞，經(jīng)800 r/min離心5 min，棄去上清，用新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。以約2×105cells/mL的活細(xì)胞密度接種至反應(yīng)器(2 L BIOSTAT B，德國(guó) B.Braun公司，在線監(jiān)控軟件MFCS/win1.1)，培養(yǎng)體積為1.5 L。反應(yīng)器操作條件：pH(7.0±0.1)，DO為50%空氣飽和度，溫度為36.8℃，攪拌轉(zhuǎn)速為80 r/min。培養(yǎng)過(guò)程中每隔約12 h取樣。培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清作生化分析。

1.3.3 反應(yīng)器中的流加培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 GS-CHO細(xì)胞，經(jīng) 800 r/min離心5 min，棄去上清，用新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。以約 1×105～2×105cells/mL 的活細(xì)胞密度接種至反應(yīng)器(2 L BIOSTAT B，德國(guó)B.Braun公司，在線監(jiān)控軟件MFCS/win1.1)，培養(yǎng)體積為1.0 L。反應(yīng)器操作條件：pH(7.0±0.1)，DO為50%空氣飽和度，溫度為36.8℃，攪拌轉(zhuǎn)速為80 r/min。培養(yǎng)過(guò)程中每隔約12 h取樣，測(cè)定葡萄糖濃度。通過(guò)葡萄糖控制模型對(duì)其進(jìn)行反饋控制。

1.4 葡萄糖控制模型

在一定條件下，特定的工程細(xì)胞株對(duì)各個(gè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗速率基本不變，并且相互之間存在一定關(guān)系[11]。因此可以選擇某一種營(yíng)養(yǎng)物的比消耗速率為基準(zhǔn)，指導(dǎo)其余營(yíng)養(yǎng)物的添加。

葡萄糖濃度檢測(cè)具有方便快捷且相對(duì)誤差小的特點(diǎn)，而且還可以通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度控制乳酸的生成。因此選擇葡萄糖為關(guān)鍵控制參數(shù)，通過(guò)測(cè)定葡萄糖在一段時(shí)間內(nèi)的消耗速率確定下一階段葡萄糖的消耗量(公式 1)，從而確定流加培養(yǎng)基體積(公式 2)，并采用連續(xù)添加的方式補(bǔ)充細(xì)胞消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

其中?gluc為下一階段葡萄糖的消耗量；qgAluvce為葡萄糖的平均比消耗速率，可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物累積消耗回歸方法計(jì)算而得；為下一階段活細(xì)胞對(duì)時(shí)間的積分值(IVC)；Vfeed為從tn到tn+1這個(gè)時(shí)間段內(nèi)添加得流加培養(yǎng)基的量；Cgluc為葡萄糖在流加培養(yǎng)基的濃度，一般為200 mmol/L。

1.5 測(cè)定和分析方法

用血球計(jì)數(shù)板點(diǎn)樣計(jì)數(shù)細(xì)胞，并用臺(tái)盼藍(lán)染色法確定細(xì)胞的存活率，每樣計(jì)數(shù) 2次，取平均值；葡萄糖和氨分別采用葡萄糖試劑盒和 Berthlet比色法氨試劑盒(上海生物制品所)測(cè)定；乳酸濃度采用乳酸脫氫酶法測(cè)定(南京建成生物工程研究所)；磷酸濃度采用磷鉍鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定[12]；氨基酸采用反相高效液相色譜系統(tǒng) ACCQ-TAG柱前衍生方法測(cè)定，其分離條件詳見(jiàn)ACCQ-TAG測(cè)試試劑包說(shuō)明；TNFR-Fc濃度采用高效親和色譜檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 批次培養(yǎng)中的營(yíng)養(yǎng)物消耗和副產(chǎn)物與融合蛋白生成

2.1.1 細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物表達(dá)

圖1A所示為GS-CHO細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的批次培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成曲線。以 0.24×106cells/mL的活細(xì)胞密度接種至新鮮的 Excell302商業(yè)培養(yǎng)基，基本未觀察到延遲期，細(xì)胞直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)培養(yǎng)至106 h時(shí)活細(xì)胞密度達(dá)到最大，為2.81×106cells/mL。隨后細(xì)胞進(jìn)入衰亡期，活細(xì)胞密度迅速下降。細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的最大比生長(zhǎng)速率為 0.80 day?1，平均比生長(zhǎng)速率為 0.66 day?1。融合蛋白濃度隨著批次培養(yǎng)的進(jìn)行不斷增加，至批次培養(yǎng)結(jié)束時(shí)融合蛋白濃度達(dá)到70.1 mg/L。

圖1 GS-CHO細(xì)胞批培養(yǎng)的生長(zhǎng)與融合蛋白表達(dá)曲線Fig.1 Cell growth and antibody production curves of GS-CHO cells in batch culture.

以融合蛋白累積生成量為縱坐標(biāo)，IVC為橫坐標(biāo)作圖(圖1B)，進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)具有良好的線性(R2＞0.95)，斜率即為融合蛋白的比生成速率，約為6.85 mg/(109cells·day)。說(shuō)明此GS-CHO細(xì)胞表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白與細(xì)胞生長(zhǎng)不相關(guān)，具有恒定的融合蛋白比生成速率。在融合蛋白比生成速率不變的前提下，融合蛋白的最終濃度與IVC成正比，因此提高活細(xì)胞密度和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間均會(huì)對(duì)最終的融合蛋白濃度起到積極的作用。

2.1.2 葡萄糖與丙酮酸的代謝

葡萄糖和丙酮酸是細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的主要能源和碳源物質(zhì)。在批次培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)環(huán)境中的葡萄糖、丙酮酸濃度變化如圖2所示。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，葡萄糖消耗較快，其平均比消耗速率約為 4.32 mmol/(109cells·day)。此時(shí)，通過(guò)糖酵途徑生成的丙酮酸速率超過(guò)了TCA循環(huán)對(duì)其的需求，因此丙酮酸溢出，培養(yǎng)上清中的丙酮酸濃度緩慢增加。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期(94 h以后)，由于葡萄糖濃度很低，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到影響，比生長(zhǎng)速率迅速下降。此外，培養(yǎng)環(huán)境中葡萄糖的耗竭還導(dǎo)致細(xì)胞本身代謝發(fā)生遷移，代謝副產(chǎn)物乳酸通過(guò)乳酸脫氫酶的作用生成丙酮酸重新進(jìn)入TCA循環(huán)。另外丙酮酸也重新被細(xì)胞利用供細(xì)胞維持所需。此現(xiàn)象表明：1)葡萄糖是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中重要的碳源和能源物質(zhì)，當(dāng)葡萄糖和丙酮酸在培養(yǎng)基中均富裕時(shí)，細(xì)胞優(yōu)先利用葡萄糖；2)當(dāng)葡萄糖耗竭時(shí)，細(xì)胞本身的代謝遷移所提供的能量不能滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需；3)流加培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中葡萄糖濃度相對(duì)富裕時(shí)，丙酮酸無(wú)需額外添加。

2.1.3 谷氨酸、谷氨酰胺及其他氨基酸的代謝

對(duì)于 GS系統(tǒng)的細(xì)胞而言，培養(yǎng)環(huán)境中的谷氨酸是細(xì)胞重要的氮源和能源物質(zhì)。谷氨酸可在谷氨酰胺合成酶作用下合成細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所必需的谷氨酰胺。圖3為培養(yǎng)過(guò)程中谷氨酸和谷氨酰胺的濃度變化。在培養(yǎng)初期，雖然培養(yǎng)環(huán)境中有大量的谷氨酸，但是GS-CHO細(xì)胞優(yōu)先利用谷氨酰胺。培養(yǎng)至 72 h后，培養(yǎng)基中的谷氨酰胺維持低濃度(約0.4 mmol/L)，與此同時(shí)培養(yǎng)上清中的谷氨酸和氨的濃度下降。這說(shuō)明，只有當(dāng)谷氨酰胺濃度耗竭或處于低濃度時(shí)，細(xì)胞才利用谷氨酰胺合成酶將谷氨酸和氨合成谷氨酰胺供細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需。

在參與GS-CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝的氮源底物中，除了谷氨酸和谷氨酰胺以外，還包括必需氨基酸，如酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、組氨酸(His)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、賴(lài)氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、纈氨酸(Val)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)，以及可自主合成的非必需氨基酸，如丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)。對(duì)批次培養(yǎng)每24 h的培養(yǎng)上清進(jìn)行氨基酸含量檢測(cè)分析，并采用營(yíng)養(yǎng)物累積消耗回歸方法計(jì)算氨基酸的比消耗速率(表 2)。結(jié)果顯示工程細(xì)胞株對(duì)不同氨基酸的消耗速率差異較大。精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和纈氨酸比消耗速率較大。而Excell302培養(yǎng)基中初始的氨基酸對(duì)于特定的工程細(xì)胞株來(lái)說(shuō)是不平衡的，需要在流加培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)一些氨基酸進(jìn)行補(bǔ)償，以平衡營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，提高氨基酸的綜合利用效率。

圖2 GS-CHO細(xì)胞批培養(yǎng)中的葡萄糖與丙酮酸代謝Fig.2 Metabolism of glucose and pyruvate in batch culture of GS-CHO.

圖3 GS-CHO細(xì)胞批培養(yǎng)中的谷氨酰胺與谷氨酸代謝Fig.3 Metabolism of glutamine and glutamate in batch culture of GS-CHO cells.

2.1.4 磷酸根的代謝

磷是磷脂雙分子層的重要組成，而且也是各種酶反應(yīng)的底物或中間物。磷酸根在工程細(xì)胞株發(fā)酵過(guò)程中消耗較大，比消耗速率約為 0.267 mmol/(109cell·day)，而在高密度培養(yǎng)后期，商業(yè)培養(yǎng)基中初始的磷酸根濃度(≈6.5 mmol/L)顯然不能滿足細(xì)胞對(duì)磷酸根的需求(圖4)。因此需要在流加培養(yǎng)過(guò)程中添加適量的磷酸根，避免磷酸根的耗竭。

表 2 批培養(yǎng)過(guò)程中氨基酸的比消耗速率及商業(yè)培養(yǎng)基中氨基酸的濃度Table 2 Specific rates of amino acids in batch culture and the concentration of those in Excell302

圖4 批培養(yǎng)過(guò)程中磷酸根離子濃度變化Fig.4 Concentrations of phosphorous in batch culture.

2.1.5 乳酸與氨的生成

乳酸和氨是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中兩個(gè)最主要的有毒副產(chǎn)物。然而對(duì)于GS-CHO來(lái)說(shuō)，細(xì)胞能夠利用谷胺酰氨合成酶將谷氨酸和氨合成谷胺酰氨。因此在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中氨濃度的變化并不顯著，氨的最大濃度為4.2 mmol/L，并且隨著谷胺酰氨耗竭，氨濃度緩慢降低。而乳酸在葡萄糖富裕時(shí)大量生成，比生成速率約為6.03 mmol/(109cells·day)，乳酸平均產(chǎn)率Ylac/Glu約為1.4 mmol/mmol(圖5)。說(shuō)明此階段約有60%的葡萄糖經(jīng)過(guò)糖酵解途徑生成丙酮酸后，在乳酸脫氫酶的作用下生成了代謝副產(chǎn)物乳酸。

圖5 乳酸和氨的生成Fig.5 Production of lactic acid and ammonia in batch culture.

從以上對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝副產(chǎn)物的分析可知，利用流加培養(yǎng)技術(shù)提高重組 CHO細(xì)胞表達(dá)TNFR-Fc融合蛋白的重點(diǎn)應(yīng)集中于優(yōu)化各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給，并且減少乳酸的生成和控制滲透壓的累積。

2.2 流加過(guò)程中葡萄糖的控制

葡萄糖檢測(cè)簡(jiǎn)便快速，且是細(xì)胞生長(zhǎng)主要的能量供體。另外細(xì)胞在高濃度葡萄糖存在的情況下會(huì)生成大量的乳酸，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。因此選擇葡萄糖作為流加培養(yǎng)過(guò)程中反饋控制參數(shù)，指導(dǎo)其余營(yíng)養(yǎng)物的添加。

在2 L反應(yīng)器中進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)富裕的批次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，考察葡萄糖濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的影響。初始葡萄糖濃度為50 mmol/L，培養(yǎng)基中氨基酸、磷酸根、金屬離子、維生素均充足，在批次培養(yǎng)結(jié)束時(shí)上述營(yíng)養(yǎng)物均未構(gòu)成限制。因此葡萄糖成為細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和產(chǎn)物合成差異的主要影響因素。圖6表示培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度與細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和乳酸比生成速率之間的關(guān)系。當(dāng)葡萄糖濃度大于5 mmol/L時(shí)，GS-CHO細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率基本保持穩(wěn)定，約為0.60～0.80 day?1。而當(dāng)其濃度低于5 mmol/L時(shí)，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率明顯下降(圖6A)。另外，批培養(yǎng)初期，由于葡萄糖充分富裕，乳酸的平均比生成速率最大，大于10 mmol/(109cells·day)，且乳酸產(chǎn)率大于 2。說(shuō)明除大量的葡萄糖通過(guò)乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為乳酸外，由其他氨基酸生成的中間代謝物丙酮酸也未進(jìn)行完全氧化，一部分從生成乳酸途徑溢出。隨著葡萄糖的消耗，乳酸的比生成速率也隨之降低。當(dāng)葡萄糖濃度小于10 mmol/L時(shí)，乳酸的比生成速率小于 5.0 mmol/(109cells·day)(圖6B)。綜上所述，當(dāng)葡萄糖在5～10 mmol/L范圍內(nèi)，細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有受到限制且有效地控制了乳酸的生成。

圖6 培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖濃度與細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、乳酸生成速率之間的關(guān)系Fig.6 Relationship of glucose concentration, cell growth rate, and lactic acid production rate.

2.3 工程細(xì)胞株在流加培養(yǎng)中生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)情況

在重組腫瘤因子受體融合蛋白的流加培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程研究中，依據(jù)理性設(shè)計(jì)方法確定營(yíng)養(yǎng)均衡的流加培養(yǎng)基。培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)葡萄糖控制模型對(duì)其進(jìn)行反饋控制，維持葡萄糖濃度5～10 mmol/L。經(jīng)過(guò)9.5 d流加培養(yǎng)，最大細(xì)胞密度和最終蛋白產(chǎn)量比批次培養(yǎng)分別提高了3.3倍和3倍，達(dá)到9.4×106cells/mL和207 mg/L(表3)。流加培養(yǎng)過(guò)程中融合蛋白的比生成速率比批次培養(yǎng)略有降低，因此最終融合蛋白濃度增加的主要原因是細(xì)胞密度的提高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)。另外培養(yǎng)環(huán)境中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度波動(dòng)不大(±20%)，僅有幾個(gè)生成氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸有明顯增加。結(jié)果說(shuō)明此動(dòng)態(tài)流加培養(yǎng)過(guò)程不僅顯著提高細(xì)胞密度和TNFR-Fc的產(chǎn)量，而且保持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。

3 結(jié)論

在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)物限制和代謝副產(chǎn)物積累是一對(duì)主要矛盾，是限制細(xì)胞生長(zhǎng)和過(guò)程產(chǎn)率的關(guān)鍵因素。而對(duì)于 GS系統(tǒng)的細(xì)胞，由于谷胺酰氨合成酶的引入，代謝副產(chǎn)物氨的累積將不再是導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)束的主要抑制因素[13]。因此通過(guò)有效的培養(yǎng)基組分設(shè)計(jì)和培養(yǎng)控制策略，合理地向細(xì)胞持續(xù)提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，減緩乳酸和滲透壓的累積，維持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，是實(shí)現(xiàn)高密度、高表達(dá)流加培養(yǎng)過(guò)程的核心。

表3 流加培養(yǎng)與批培養(yǎng)參數(shù)的比較Table 3 Comparison of batch and fed-batch data for GS-CHO

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GS-CHO細(xì)胞的代謝特性，以動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析為基礎(chǔ)，定量添加特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)償，提高培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的綜合利用效率。另外以葡萄糖為關(guān)鍵控制參數(shù)，通過(guò)離線測(cè)定培養(yǎng)上清葡萄糖的濃度反饋控制流加培養(yǎng)過(guò)程。在流加培養(yǎng)過(guò)程中，乳酸比生成速率比批次培養(yǎng)降低40%，活細(xì)胞密度相應(yīng)提高且延長(zhǎng)了生產(chǎn)周期，最終產(chǎn)量也得到了相應(yīng)地提高。

單位體積培養(yǎng)液的抗體產(chǎn)量與宿主細(xì)胞的抗體表達(dá)水平、培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞密度和培養(yǎng)周期有著密切的關(guān)系。此流加培養(yǎng)過(guò)程中最終產(chǎn)物濃度的增加主要是因?yàn)榕囵B(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞密度增加和培養(yǎng)周期延長(zhǎng)，而細(xì)胞本身的蛋白表達(dá)水平略有下降。因此，通過(guò)改變培養(yǎng)參數(shù)(溫度、溶氧水平、pH和滲透壓)和添加一些刺激細(xì)胞蛋白表達(dá)的化學(xué)物質(zhì)(DMSO、丁酸鈉)等方法提高重組蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，可望進(jìn)一步提高最終融合蛋白濃度[14-15]。

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Development of a fed-batch process for TNFR-Fc producing GS-CHO cells

Li Fan, Liang Zhao, Yating Sun, Tianci Kou, and Wensong Tan
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Received:September 16, 2009;Accepted:November 11, 2009

Corresponding author:Wensong Tan.Tel: +86-21-64250948; Fax: +86-21-64252250; E-mail: wstan@ecust.edu.cn