利用SPT3的定向進(jìn)化提高工業(yè)釀酒酵母乙醇耐受性

趙心清，姜如嬌，李寧，楊晴，白鳳武

大連理工大學(xué)生物科學(xué)與工程系，大連 116024

利用SPT3的定向進(jìn)化提高工業(yè)釀酒酵母乙醇耐受性

趙心清，姜如嬌，李寧，楊晴，白鳳武

大連理工大學(xué)生物科學(xué)與工程系，大連 116024

利用對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的定向進(jìn)化可對(duì)多基因控制的性狀進(jìn)行有效的代謝工程改造。本研究對(duì)釀酒酵母負(fù)責(zé)脅迫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的SAGA復(fù)合體成分SPT3編碼基因進(jìn)行易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變，并研究了SPT3的定向進(jìn)化對(duì)釀酒酵母乙醇耐性的影響。將SPT3的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物連接改造的pYES2.0表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 4126，構(gòu)建了突變體文庫(kù)。通過(guò)篩選在高濃度乙醇中耐受性提高的突變株，獲得了一株在10%(V/V)乙醇中生長(zhǎng)較好的突變株M25。該突變株利用125 g/L的葡萄糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵時(shí)，終點(diǎn)乙醇產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了11.7%。由此表明，SPT3是對(duì)釀酒酵母乙醇耐性進(jìn)行代謝工程改造的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子。

定向進(jìn)化，乙醇耐性，SPT3，釀酒酵母，易錯(cuò)PCR

Abstract:Directed evolution of transcription factors can be employed to effectively improve the phenotypes which are controlled by multiple genetic loci.In this study, we used error-prone PCR for the directed evolution of SPT3, which is the component of yeast Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase(SAGA)complex responsible for the transcription of stress-related genes,and studied its effect on the improvement of ethanol tolerance.Mutant library was constructed by ligating the error-prone PCR products with a modified pYES2.0 plasmid, and the expression plasmids were subsequently transformed to yeast industrial strain Saccharomyces cerevisiae 4126.One mutant strain M25 showing superior growth in presence of 10% ethanol was selected.M25 produced 11.7% more ethanol than the control strain harboring the empty vector when 125 g/L glucose was used as substrate.This study revealed that SPT3 is an important transcription factor for the metabolic engineering of yeast ethanol tolerance.

Keywords:directed evolution, ethanol tolerance, SPT3, Saccharomyces cerevisiae, error-prone PCR

利用易錯(cuò)PCR(Error prone PCR)或DNA 改組(DNA shuffling)對(duì)酶分子編碼基因進(jìn)行的定向進(jìn)化，可獲得催化效率提高的酶蛋白，并改善酶的一系列性質(zhì)，如穩(wěn)定性[1-2]、底物特異性[3]等，是蛋白質(zhì)工程的重要研究工具。近年來(lái)，定向進(jìn)化技術(shù)也成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄因子等控制細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白的突變，并在酵母菌[4]、乳桿菌[5]等微生物的代謝工程改造中得到成功應(yīng)用。酵母菌的乙醇耐受性與多個(gè)基因有關(guān)[6]，因而通過(guò)傳統(tǒng)的單基因敲除或過(guò)量表達(dá)很難達(dá)到提高酵母菌乙醇耐性的目的。2006年Alper等報(bào)道了通過(guò)全局轉(zhuǎn)錄工程(Global transcriptional machinery engineering，gTME)的方法提高酵母菌乙醇耐性的開(kāi)創(chuàng)性研究，為酵母菌乙醇耐性的代謝工程操作提供了新的思路[4]。對(duì)乙醇耐性提高的突變菌株中SPT15蛋白的突變分析表明，其編碼蛋白有3個(gè)氨基酸殘基的突變，而對(duì)這 3個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)的單獨(dú)定點(diǎn)突變并沒(méi)有起到同樣的效果，因此作者提出，這 3個(gè)氨基酸同時(shí)突變的結(jié)果可能影響了SPT15與SPT3蛋白的結(jié)合，因?yàn)檫@3個(gè)突變?cè)赟PT3基因敲除突變體中沒(méi)有起到同樣的突變效果[4]。

SPT3是酵母菌轉(zhuǎn)錄起始共激活因子復(fù)合體SAGA(Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase)的成分之一，負(fù)責(zé)引導(dǎo)TATA結(jié)合蛋白TBP(TATA-binding protein)結(jié)合到特定的啟動(dòng)子區(qū)[7]，近年的研究發(fā)現(xiàn)，SAGA復(fù)合體與多種環(huán)境脅迫因素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，這些脅迫因素包括高溫、營(yíng)養(yǎng)缺乏、DNA損傷等[8]。而SPT3的功能還不僅限于SAGA復(fù)合體成分，研究表明SPT3還與Ccr4-Not 復(fù)合體的功能有關(guān)[9]，而這個(gè)復(fù)合體可影響酵母細(xì)胞內(nèi)多種生理代謝過(guò)程，包括影響乙醇脫氫酶ADH2基因[10]等可能與乙醇發(fā)酵相關(guān)的基因的表達(dá)。此外，SPT3還參與調(diào)控酵母菌 NADP-特異性谷氨酸脫氫酶基因GDH1的調(diào)控，從而影響細(xì)胞內(nèi)的輔酶平衡[11]。因此，SPT3基因在酵母細(xì)胞生長(zhǎng)代謝以及乙醇合成等多方面生理過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，而且這種調(diào)節(jié)作用不局限于已報(bào)道的與SPT3與SPT15的結(jié)合，SPT3的其他功能也可能對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄機(jī)制產(chǎn)生重要影響。

國(guó)內(nèi)學(xué)者利用gTME技術(shù)，對(duì)SPT15基因進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得了高效利用木糖并共代謝木糖和葡萄糖的釀酒酵母菌株[12]，但對(duì) SPT3在乙醇耐性中的研究還沒(méi)有報(bào)道。在利用酵母單基因缺失突變體研究與乙醇耐性相關(guān)基因的報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)SPT3缺失突變體對(duì)乙醇的敏感性提高，暗示了SPT3在釀酒酵母乙醇耐性中的重要作用[13]。本研究通過(guò)對(duì) SPT3編碼基因進(jìn)行易錯(cuò)PCR，構(gòu)建了突變體文庫(kù)，并研究了SPT3的定向進(jìn)化對(duì)釀酒酵母乙醇耐性的影響，證明了SPT3的突變可提高釀酒酵母的乙醇耐受性。

1 材料和方法

1.1 微生物菌種和培養(yǎng)基

大腸桿菌E.coli DH5α、工業(yè)釀酒酵母S.cerevisiae 4126[14]為本實(shí)驗(yàn)室保存。釀酒酵母菌株S288C由瑞典 Chalmers大學(xué) Jens Nielson教授惠贈(zèng)。質(zhì)粒pFA6a-kanMX4由清華大學(xué)陳國(guó)強(qiáng)教授惠贈(zèng)。大腸桿菌-酵母穿梭載體pYES2.0由大連理工大學(xué)李文利副教授惠贈(zèng)。

大腸桿菌用 LB 培養(yǎng)基(g/L：酵母粉 5，胰蛋白胨10，NaCl 10)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)添加50 μg/mL氨芐青霉素。釀酒酵母轉(zhuǎn)化子用 YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)(g/L：酵母粉 4，蛋白胨 3，葡萄糖 20)，液體培養(yǎng)時(shí)添加 100 μg/mL G418，固體培養(yǎng)時(shí)添加 300 μg/mL G418。乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L：酵母粉5，蛋白胨4，葡萄糖125)。PCR相關(guān)試劑、T4 DNA連接酶、DNA快速連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、pMD 20-T Vector均為寶生物工程(大連)有限公司的產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶Nde I、Nhe I購(gòu)自NEB公司。DNA純化試劑盒為GE公司產(chǎn)品。凝膠回收試劑盒、抗生素購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母基因組的提取

釀酒酵母S288C基因組DNA的提取參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行，作為擴(kuò)增SPT3基因的模板。

1.2.2 SPT3表達(dá)載體pRJ04及易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)的構(gòu)建

本研究中所用的引物序列見(jiàn)表 1。引物 Kan-F/Kan-R用于擴(kuò)增G418抗性標(biāo)記基因，在正向引物中加入Nhe I酶切位點(diǎn)，反向引物中加入Nde I酶切位點(diǎn)。以質(zhì)粒pFA6a-kanMX4為模板，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD 20-T Vector，構(gòu)建pMD20-T Kan。再分別對(duì)pYES2.0和pMD20-T Kan進(jìn)行Nde I/Nhe I雙酶切，凝膠回收5.7 kb的pYES2.0載體骨架片段和1.5 kb的pMD20-T 的Kan片段并連接，構(gòu)建pYES2.0骨架上引入G418抗性基因的pRJ01。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

采用引物SPT3-F/SPT3-R(分別帶有BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn))擴(kuò)增得到SPT3基因，并連接到pMD 20-T Vector，得到pRJ02質(zhì)粒。再利用EcoR I/BamH I酶切 pRJ01和 pRJ02，構(gòu)建 pYES 2.0骨架上含有SPT3和G418抗性基因的pRJ03。利用引物PGK-F/PGK-R(分別帶有 Age I和 BamH I酶切位點(diǎn))擴(kuò)增PGK啟動(dòng)子，將啟動(dòng)子連接入pRJ03，獲得SPT3表達(dá)載體pRJ04。

易錯(cuò) PCR突變反應(yīng)體系如下：SPT3-F/SPT3-R(10 pmol/L 各 1 μL，10× buffer(Mg2+free)2.5 μL，Taq 酶 0.1 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μL，pRJ02 2 μL，MnCl2(5 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)7 μL，ddH2O 補(bǔ)充至 25 μL。PCR 擴(kuò)增條件為 94℃ 30 s；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min 。將獲得的載體混合物經(jīng)BamH I和EcoR I酶切，連接入經(jīng)同樣酶切處理的pRJ04，構(gòu)建SPT3表達(dá)載體的易錯(cuò)PCR文庫(kù)，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，構(gòu)建突變體基因文庫(kù)。提取突變基因文庫(kù)的質(zhì)粒，將混合質(zhì)粒用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母S.cerevisiae 4126，獲得的酵母轉(zhuǎn)化子構(gòu)成酵母突變體文庫(kù)，共獲得429個(gè)酵母菌落。將pRJ01空載體轉(zhuǎn)化4126酵母菌株，獲得酵母對(duì)照菌株。

1.2.3 SPT3突變體酵母文庫(kù)的篩選

利用在高濃度乙醇中培養(yǎng)的方法富集乙醇耐性提高的突變體。將酵母突變體文庫(kù)平板上的克隆用適量YPD液體培養(yǎng)基洗入搖瓶，于YPD液體培養(yǎng)基中30℃、150 r/min培養(yǎng)16 h。以2%接種量接種于含10%乙醇的YPD中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，然后取 1 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于 50 mL含 12%乙醇的YPD中，培養(yǎng)24 h后稀釋涂平板。2 d后生長(zhǎng)出來(lái)的菌落進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，挑選較大的單菌落在試管中用3 mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃、150 r/min培養(yǎng)16 h，測(cè)量其OD600，并按照相同起始OD600值接種于含10%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基，48 h后測(cè)量其OD600吸收值。取在10%乙醇中生長(zhǎng)好于對(duì)照的突變體，按2%的接種量接種于250 mL搖瓶(內(nèi)有50 mL含10%乙醇的YPD)中，控制起始OD值一致，48 h后測(cè)量OD600，比較其生長(zhǎng)情況，與含有空載體的對(duì)照菌株相比在10%乙醇中生長(zhǎng)最好的為乙醇耐性提高的突變體。

1.2.4 突變體乙醇耐性和發(fā)酵性能的研究

將在YPD斜面上活化培養(yǎng)后的菌株接種于乙醇濃度為10%的YPD液體培養(yǎng)基中，150 r/min、30℃條件下培養(yǎng)，定期測(cè)量菌體OD600，繪制生長(zhǎng)曲線，以菌體 OD值表征乙醇耐性，同時(shí)檢測(cè)在不含有乙醇的YPD液體培養(yǎng)基中各菌株的生長(zhǎng)情況。

將菌株在YPD斜面上活化培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min、30℃條件下培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)量發(fā)酵液的乙醇濃度。乙醇濃度的檢測(cè)用HPLC方法，參考文獻(xiàn)[16]。

菌株的生長(zhǎng)測(cè)定和乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少 2次，每次實(shí)驗(yàn)至少有2個(gè)平行，結(jié)果取測(cè)試的平均值，所有結(jié)果都具有可重復(fù)性。

1.2.5 突變體的遺傳穩(wěn)定性研究

突變體在含有YPD的斜面?zhèn)鞔?，?8 h轉(zhuǎn)接1次，共傳代 9次，用傳代后的菌種進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并和傳代初的菌種進(jìn)行比較，研究其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPT3對(duì)酵母菌乙醇耐性的影響

雖然 SPT3的缺失導(dǎo)致釀酒酵母在乙醇中的生長(zhǎng)受到抑制[13]，但對(duì)其過(guò)量表達(dá)后乙醇耐性的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步確定SPT3與釀酒酵母乙醇耐性的關(guān)系，首先比較了SPT3過(guò)量表達(dá)菌株的生長(zhǎng)和對(duì)高濃度乙醇的反應(yīng)。SPT3過(guò)量表達(dá)菌株的生長(zhǎng)與含有空載體的對(duì)照菌株基本一致，在10%乙醇中的生長(zhǎng)也與對(duì)照無(wú)明顯差別(結(jié)果未顯示)，說(shuō)明過(guò)量積累SPT3對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)和代謝沒(méi)有明顯影響。進(jìn)一步研究了 SPT3突變基因?qū)︶劸平湍妇闟.cerevisiae 4126乙醇耐性的影響，在易錯(cuò)PCR突變體文庫(kù)中隨機(jī)挑取2個(gè)突變體M1和M2進(jìn)行SPT3突變基因測(cè)序，并研究了2個(gè)突變體在10%乙醇中的生長(zhǎng)情況。突變體在YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)與對(duì)照類似，但在10%的乙醇中，突變體的生長(zhǎng)明顯滯后于對(duì)照菌株，體現(xiàn)在延遲期的延長(zhǎng)和最終生物量的明顯減少，測(cè)序結(jié)果表明，M1突變體中SPT3基因有6個(gè)氨基酸突變，其中 253位的Lys突變?yōu)榻K止密碼，M2突變株同樣具有6個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，分別分散在SPT3的N端和C端不同區(qū)域。上述結(jié)果表明，SPT3在酵母菌乙醇耐性中具有重要作用，其隨機(jī)突變后有可能篩選到乙醇耐性提高的突變體。

2.2 SPT3易錯(cuò)PCR突變體文庫(kù)的篩選和突變體乙醇耐性和溫度耐性的研究

對(duì)SPT3的易錯(cuò)PCR突變體文庫(kù)中的單菌落進(jìn)行乙醇耐性的富集篩選，在初篩中獲得了11株乙醇耐性高于對(duì)照的突變體，在搖瓶復(fù)篩中獲得了乙醇耐性提高最明顯的突變體M25。該突變體在YPD液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)與對(duì)照相似，但在10%乙醇中的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于對(duì)照株(圖1)，尤其在對(duì)數(shù)期差異最明顯，36 h的OD600值是對(duì)照的2.62倍。

由于文獻(xiàn)報(bào)道 SAGA復(fù)合體還與溫度脅迫有關(guān)[8]，本實(shí)驗(yàn)在不同培養(yǎng)溫度下進(jìn)行了突變體文庫(kù)的篩選，但突變體文庫(kù)在37℃、40℃溫度下未篩選到耐高溫的突變體，將耐乙醇的突變體在不同高溫條件下(37℃、40℃)培養(yǎng)，也未發(fā)現(xiàn)耐溫性的明顯變化，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)條件下未得到溫度耐性改變的突變體，SPT3的突變能否引起酵母菌溫度耐性的提高有待進(jìn)一步研究。

2.3 突變株M25的乙醇發(fā)酵性能

對(duì)突變株M25和對(duì)照菌株的乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，32 h后，突變株和野生型均將培養(yǎng)基中的糖耗盡(數(shù)據(jù)未顯示)，細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯差別(圖2A)，但突變株M25的發(fā)酵終點(diǎn)乙醇產(chǎn)量略高于對(duì)照株(圖2B)，對(duì)照菌株36 h發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇為48.0 g/L，而突變株為53.6 g/L，乙醇體積產(chǎn)率達(dá)到1.675 g/(L·h)，比對(duì)照株提高了11.7%。突變體在多次傳代后檢測(cè)遺傳穩(wěn)定性，證明發(fā)酵性能比較穩(wěn)定。

2.4 突變株的SPT3基因突變位點(diǎn)

對(duì)突變株 M25中的 SPT3基因進(jìn)行測(cè)序結(jié)果表明，SPT3蛋白的337個(gè)氨基酸中，共8處氨基酸殘基發(fā)生了突變，分別為：Ser18Pro、Ile59Thr、Thr104Ser、Lys135Arg、Arg177Gly、Lys179Glu、Cys199Ser、Asp214Gly。其中個(gè)別殘基的突變，如18、59、177、214位氨基酸的突變改變了側(cè)鏈的極性，可能造成蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化，從而影響SPT3與其他蛋白復(fù)合體成分的結(jié)合，從而影響多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)突變位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，并研究單獨(dú)或組合定點(diǎn)突變對(duì)乙醇耐性的影響，可獲得SPT3蛋白中對(duì)乙醇耐性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基的信息。

圖1 突變體M25與對(duì)照菌株在10%乙醇中生長(zhǎng)的差別Fig.1 Growth difference of mutant strain M25 in 10% ethanol comparing with that of control.

圖2 突變體M25和對(duì)照菌發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)(A)和乙醇產(chǎn)量(B)比較Fig.2 Cell growth(A)and ethanol production(B)of mutant M25 comparing with that of control.

2006年Stephanopoulos研究小組首次報(bào)道通過(guò)全局轉(zhuǎn)錄工程(gTME)提高酵母菌的乙醇耐性，發(fā)現(xiàn)了酵母 RNA聚合酶 II轉(zhuǎn)錄復(fù)合體 TFIID成分SPT15中3個(gè)氨基酸的突變提高了酵母菌的乙醇耐性和乙醇產(chǎn)量[4]。他們采用的是低拷貝載體和弱啟動(dòng)子，目前還不清楚突變基因拷貝數(shù)的多少和啟動(dòng)子的強(qiáng)弱對(duì)突變體生理特性的影響，以及SPT3的突變頻率對(duì)乙醇耐性的影響。進(jìn)一步的研究將利用多種表達(dá)載體和啟動(dòng)子活性研究對(duì)突變文庫(kù)特性的影響，已經(jīng)證明提高易錯(cuò)PCR體系的模板量可降低突變頻率，未來(lái)的研究將深入揭示SPT3的突變?cè)卺劸平湍敢掖寄托灾械淖饔谩?/p>

Madison和 Winsto研究了乳酸克魯維酵母Kluyveromyces lactis、裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe和Clavispora opuntiae中的SPT3，證明了在不同的酵母中 SPT3的功能是保守的[17]。目前還不清楚導(dǎo)致釀酒酵母乙醇耐性提高的 SPT3的突變是否也可以提高其他酵母的乙醇耐受性和脅迫耐受性。BLAST搜索顯示，多種低等真核生物都有SPT3同源的蛋白，在人類基因組中也有與SPT3部分同源的蛋白[18]，對(duì)這些蛋白與各種脅迫因素的深入研究將進(jìn)一步揭示SPT3對(duì)不同生物細(xì)胞代謝的深刻影響。

在本文的準(zhǔn)備過(guò)程中，Hou等報(bào)道了在工業(yè)酵母 S.cerevisiae TH-AADY中過(guò)量表達(dá) SPT3和SPT15突變基因提高酵母菌乙醇耐性的結(jié)果[18]，在他們的研究中，過(guò)量表達(dá)SPT3提高了酵母菌的乙醇耐受性，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一致，推測(cè)SPT3的作用可能和酵母菌的遺傳背景有關(guān)。而本研究首次報(bào)道了利用SPT3的定向進(jìn)化提高酵母菌的乙醇耐受性，為構(gòu)建乙醇耐性提高的工業(yè)酵母菌株奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中 SPT3的定向進(jìn)化得到了多株乙醇耐性提高的突變體，但多數(shù)突變體乙醇發(fā)酵性能沒(méi)有明顯變化。進(jìn)一步優(yōu)化突變頻率，調(diào)節(jié)載體拷貝數(shù)和調(diào)節(jié)啟動(dòng)子活性，可能獲得乙醇耐性、滲透耐性、高溫耐性和乙醇產(chǎn)量均提高的新一代工業(yè)乙醇酵母。

3 結(jié)論

利用釀酒酵母 SPT3基因的易錯(cuò) PCR，建立突變體文庫(kù)，獲得了乙醇耐性提高的釀酒酵母突變體，證明 SPT3基因可用于釀酒酵母乙醇耐性的代謝工程改造，本研究提供了利用全局轉(zhuǎn)錄工程(gTME)技術(shù)提高酵母菌乙醇耐性的又一個(gè)靶點(diǎn)基因。進(jìn)一步的研究將揭示突變株乙醇耐性提高的分子機(jī)制，為構(gòu)建乙醇耐受性和其他脅迫耐性提高的工業(yè)酵母，提高乙醇發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)技術(shù)水平奠定了基礎(chǔ)。

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Xinqing Zhao, Rujiao Jiang, Ning Li, Qing Yang, and Fengwu Bai
Department of Bioscience and Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China

Received:October 16, 2009;Accepted:December 15, 2009

Supported by:Natural Science Foundation of China(No.30500011), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA10Z358).

Corresponding author:Xinqing Zhao.Tel: +86-411-84706308; Fax: +86-411-84706329; E-mail: xqzhao@dlut.edu.cn國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30500011)，國(guó)家高科技研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2007AA10Z358)資助。