克雷伯桿菌甘油脫氫酶和1,3-丙二醇氧化還原酶的動力學(xué)機制

陳宏文，聶金峰，陳國，方柏山

華僑大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室，廈門 361021

克雷伯桿菌甘油脫氫酶和1,3-丙二醇氧化還原酶的動力學(xué)機制

陳宏文，聶金峰，陳國，方柏山

華僑大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室，廈門 361021

本研究主要對克雷伯桿菌甘油轉(zhuǎn)化1,3-丙二醇代謝途徑中的2個關(guān)鍵酶甘油脫氫酶(GDH)、1,3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)反應(yīng)機制和動力學(xué)進行了研究。首先，通過初速度和產(chǎn)物抑制動力學(xué)研究確定了GDH、PDOR雙底物酶促反應(yīng)機制為有序BiBi機制，明確了由反應(yīng)物消耗到產(chǎn)物生成之間的歷程。其次，建立了GDH、PDOR雙底物酶促反應(yīng)動力學(xué)模型，由動力學(xué)模型可知，在偶合反應(yīng)中，如果GDH和PDOR酶量相同，GDH氧化反應(yīng)成為限速反應(yīng)，而輔酶I將主要以氧化型NAD+形式存在。動力學(xué)信息為酶法合成1,3-丙二醇和代謝工程研究提供理論指導(dǎo)。

甘油脫氫酶，1,3-丙二醇氧化還原酶，有序BiBi機制，動力學(xué)模型

Abstract:The kinetic mechanisms of two key enzymes in the biotransformation of glycerol to 1,3-propanediol(1,3-PD)by Klebsiella pneumoniae, glycerol dehydrogenase(GDH)and 1,3-propanediol oxidoreductase(PDOR), was characterized.Kinetics on initial velocity and product inhibition revealed that GDH and PDOR follow an ordered Bi-Bi sequential mechanism.Kinetic models for GDH and PDOR showed that the oxidation reaction catalyzed by GDH was the rate-limiting step in coupled enzymatic reaction when the GDH/PDOR was 1:1, and the NAD+was the main form of coenzyme in the reaction.Knowledge about the kinetic mechanisms will be helpful to understand how these enzymes is regulated, which will be useful for further enzyme catalysis and metabolic engineering studies.

Keywords:glycerol dehydrogenase, 1,3-propanediol oxidoreductase, ordered Bi-Bi mechanism, kinetic model

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一種重要的化工原料，它可作為抗凍劑、多種增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料，也可用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。它最主要的用途是作為新型聚酯(如PTT)、聚醚和聚亞氨酯的單體[1]。1,3-PD的生產(chǎn)方法有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法。近年來，生物轉(zhuǎn)化法以其利用可再生資源、對環(huán)境友好等特點日益受到人們的重視。能將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD的微生物主要包括克雷伯桿菌屬、檸檬菌屬及梭狀芽孢桿菌屬等。

甘油脫氫酶(GDH，EC 1.1.1.6)和1,3-丙二醇氧化還原酶(PDOR，EC 1.1.1.202)是甘油(Gly)轉(zhuǎn)化 1,3-PD過程中的兩個關(guān)鍵酶，它們的活力與1,3-PD的產(chǎn)率密切相關(guān)[2]。在甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD的厭氧發(fā)酵途徑中，依賴NAD+的GDH控制著甘油到二羥基丙酮(DHA)的氧化反應(yīng)，依賴 NADH的PDOR控制著 3-羥基丙醛(3-HPA)到 1,3-PD的還原反應(yīng)。輔酶Ⅰ的再生和平衡通過 GDH和 PDOR的自氧化還原實現(xiàn)。依賴輔酶維生素B12的甘油脫水酶(GDHt，EC 4.2.1.30)調(diào)控著甘油到3-HPA的轉(zhuǎn)化。目前已有一些關(guān)于GDH和PDOR的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)方面的研究，而關(guān)于 GDH特別是PDOR催化機制的深入研究國內(nèi)外鮮有報道。本研究室已從克雷伯桿菌中分離純化了 GDH和PDOR[3-4]，且生物法合成 3-HPA[5]，為動力學(xué)機制研究打下基礎(chǔ)。本研究通過催化機制的研究，提供了 GDH和PDOR的雙底物催化動力學(xué)模型，動力學(xué)信息的提供有助于深入理解伴有輔酶再生的酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，為今后的酶法合成 1,3-PD、代謝工程研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

克雷伯桿菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026由德國生物技術(shù)中心曾安平博士惠贈。DHA為英國BDH公司產(chǎn)品。甘油、1,3-PD、NAD(H)等購自上?；瘜W(xué)試劑公司。3-HPA為本實驗室自制[5]。

1.2 GDH和PDOR的純化

來源于克雷伯桿菌的GDH和PDOR經(jīng)過DEAE Sepharose(或 Fast Flow Q Sepharose Fast Flow)離子交換層析和Blue Sepharose CL-6B親和層析得到分離純化[3-4]。

1.3 GDH和PDOR的催化反應(yīng)

GDH、PDOR酶活力用初速度法測定，參考Ahrens等[1]的方法并適當(dāng)修改。1.5 mL GDH酶活力分析反應(yīng)液含有30 mmol/L(NH4)2SO4、0.2 mol/L甘油、2 mmol/L NAD+、1 μmol/L Fe(NH4)2(SO4)2、0.1 mol/L碳酸鉀緩沖溶液(pH 12.0)。45℃條件下，加入適量酶液啟動反應(yīng)，紫外分光光度計340 nm波長下測定吸光度的變化(NADH形成)。PDOR酶活力測定以1,3-PD為底物(碳酸鉀緩沖溶液pH 9.5)，其余步驟同GDH酶活力測定方法。酶活力定義為：在上述條件下，每分鐘還原1 μmol底物的酶量為1個單位。

動力學(xué)機制實驗分成兩組。第一組為不含產(chǎn)物的初速度實驗，對于 GDH，分別固定 Gly濃度(0.025、0.5、0.1、0.2 mol/L)，初速度法測定不同NAD+濃度(0.2、0.1、0.067、0.047及 0.04 mmol/L)下的初速度；對于 PDOR，分別固定 3-HPA濃度(0.01、0.025、0.05、0.075 mol/L)，初速度法測定不同NADH濃度下的初速度。第二組為產(chǎn)物抑制實驗，對于GDH，在含不同產(chǎn)物NADH(或DHA)濃度的測活體系中，固定酶和Gly(或NAD+)的濃度，改變底物NAD+(或Gly)濃度，測定酶促反應(yīng)初速度；對于 PDOR，在含不同產(chǎn)物 NAD+(或 1,3-PD)濃度的測活體系中，固定酶和3-HPA(或NADH)的濃度，改變底物NADH(或3-HPA)濃度，測定酶促反應(yīng)初速度。所有動力學(xué)實驗平行3次，所有實驗數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～1.5%范圍內(nèi)。

1.4 動力學(xué)數(shù)據(jù)分析

雙底物酶促反應(yīng)機制主要有有序機制、隨機機制和乒乓機制。有序機制和快速平衡的隨機機制中，兩種底物在酶促反應(yīng)中與酶分子上的特定位點結(jié)合形成非共價三元復(fù)合物。乒乓機制反應(yīng)中不形成三元復(fù)合物，在第二個底物結(jié)合上去之前，第一個底物已經(jīng)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物并從酶上釋放出來。如果酶促反應(yīng)為有序 BiBi反應(yīng)或快速平衡的隨機 BiBi反應(yīng)，則其實驗數(shù)據(jù)符合如下的初速度方程和雙倒數(shù)方程(穩(wěn)態(tài)條件下推導(dǎo)的速度方程)[6]：

其中，S1為先與酶結(jié)合的第一底物，S2為后與酶結(jié)合的第二底物， KmS1和KmS2分別是以 S1、S2為底物的米氏常數(shù)，KiS1是第一底物的解離常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)初速度。實驗室自制的3-HPA沒有完全提純，對于PDOR(1)式中 KmS1、KmS2分別是以S1、S2為底物的表觀米氏常數(shù)。

如果酶促反應(yīng)是乒乓BiBi反應(yīng)，則其實驗數(shù)據(jù)應(yīng)符合下面的初速度方程和雙倒數(shù)方程[6]：

其中，符號含義同上。如果實驗數(shù)據(jù)不符合上面任何一個雙倒數(shù)直線方程，則反應(yīng)可能具有穩(wěn)態(tài)隨機BiBi反應(yīng)機制。

2 結(jié)果和討論

2.1 初速度研究

不含產(chǎn)物條件下，研究了GDH和PDOR雙底物動力學(xué)。由于無法獲得純的 PDOR，實驗所用的PDOR還含有少量GDH[4]。GDH對生理反應(yīng)底物甘油等含有相鄰羥基的醇類有較強的專一性，但對單羥基的 3-HPA和非相鄰羥基的 1,3-丙二醇(PDOR酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物)等活性則很低[3]，因此GDH對于 PDOR機制鑒別和動力學(xué)的影響可忽略。初速度法測定不同底物 NAD+(GDH)和 NADH(PDOR)濃度下的初速度。將對作圖，結(jié)果如圖1和圖2所示。所得到的曲線均為一簇交于第二象限的直線，這表明GDH和PDOR酶促反應(yīng)為有序或快速平衡的隨機BiBi反應(yīng)。如果為乒乓BiBi反應(yīng)，則一簇直線相互平行，斜率相同。如果酶促反應(yīng)是穩(wěn)態(tài)隨機BiBi反應(yīng)，則雙倒數(shù)圖是非線性的。這些結(jié)果也說明GDH和PDOR酶促反應(yīng)在產(chǎn)物釋放之前，其兩種底物會與酶形成三元復(fù)合物。另外，雙倒數(shù)圖中的一簇直線沒有集中在X軸上，說明兩種底物與酶結(jié)合時會相互影響。

2.2 產(chǎn)物抑制

為進一步確定GDH和PDOR反應(yīng)機制，分別在產(chǎn)物存在條件下，測定GDH和PDOR酶促反應(yīng)初速度。雙倒數(shù)作圖實驗結(jié)果顯示，對于 GDH，NADH對 NAD+只有斜率效應(yīng)而無截距效應(yīng)(圖3A)，表明產(chǎn)物NADH對NAD+的抑制類型為競爭性抑制，而產(chǎn)物 DHA 對 NAD+的抑制類型為非競爭性抑制(圖3B)，對 Gly抑制機理表現(xiàn)為混合型抑制(圖3C)。PDOR酶促反應(yīng)模式與 GDH類似，產(chǎn)物 NAD+對NADH的抑制為競爭性抑制(圖4A)，產(chǎn)物1,3-PD對NADH和3-HPA的抑制為混合型抑制(圖4B、C)。

圖1 GDH氧化反應(yīng)的雙倒數(shù)關(guān)系圖Fig.1 Double reciprocal plots for the oxidation reaction of GDH.

圖2 PDOR還原反應(yīng)的雙倒數(shù)關(guān)系圖Fig.2 Double reciprocal plots for the reduction reaction of PDOR.

圖3 GDH產(chǎn)物抑制的雙倒數(shù)關(guān)系圖Fig.3 Double reciprocal plots for product inhibition on GDH.(A)Product inhibition by NADH on GDH.(B)Product inhibition by DHA on GDH.(C)Product inhibition by DHA on GDH.

通過產(chǎn)物抑制作用的研究說明 GDH和 PDOR雙底物催化反應(yīng)中，在不同產(chǎn)物濃度下，產(chǎn)物抑制作用既有競爭性抑制又有非競爭性抑制和混合型抑制，而不是表觀為快速平衡隨機反應(yīng)中的全部為競爭性抑制(底物不飽和)或不抑制現(xiàn)象(底物飽和)，因此GDH和PDOR雙底物酶促反應(yīng)均為有序BiBi反應(yīng)。

圖4 PDOR產(chǎn)物抑制的雙倒數(shù)關(guān)系圖Fig.4 Double reciprocal plots for product inhibition on PDOR.(A)Product inhibition by NAD+on PDOR.(B)Product inhibition by 1,3-PD on PDOR.(C)Product inhibition by 1,3-PD on PDOR.

競爭性的產(chǎn)物抑制為底物結(jié)合和產(chǎn)物釋放順序提供了線索。因為抑制劑與可變底物結(jié)合于同一種酶形式才能看到競爭性抑制作用，對于有序BiBi反應(yīng)來說，只有第一個底物和最后一個產(chǎn)物才能與同一種酶形式(自由酶 E)結(jié)合，所以對于 GDH，可變底物 NAD+必為第一個底物，而競爭性產(chǎn)物抑制劑 NADH必為最后一個釋放的產(chǎn)物，由于 BiBi反應(yīng)只有兩種底物和兩種產(chǎn)物，這樣整個反應(yīng)次序即可決定。即其中NAD+是第一底物，Gly是第二底物，DHA是首先釋放的第一產(chǎn)物，NADH是隨后釋放的第二產(chǎn)物，GDH氧化反應(yīng)的過程如圖5(A)所示。同理，PDOR還原反應(yīng)中，NADH是第一底物，3-HPA是第二底物，1,3-PD是第一產(chǎn)物，NAD+是第二產(chǎn)物，反應(yīng)過程如圖5(B)所示。

圖5 GDH(A)和 PDOR(B)有序 BiBi機制Fig.5 Ordered BiBi mechanism of GDH(A)and PDOR(B).

2.3 雙底物酶促反應(yīng)速度方程及動力學(xué)常數(shù)求解

以GDH為例，反應(yīng)為有序BiBi反應(yīng)，其酶促反應(yīng)速度方程符合(1)式，雙倒數(shù)方程符合(2)式，從(2)式可知，以對作圖為直線(圖1)，其直線斜率為，截距為。以圖1的截距、斜率分別對二次作圖(圖略)，可測得相關(guān)動力學(xué)常數(shù)。同樣求得PDOR有序BiBi反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)，結(jié)果見表1。GDH反應(yīng)由于 KmS1?KmS2，說明 E-DHA-NADH的分解是整個反應(yīng)的限速反應(yīng)，可用快速平衡法推導(dǎo)的有序 BiBi速度方程表示 GDH的氧化反應(yīng)動力學(xué)方程，即：

表1 GDH、PDOR有序BiBi反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Table 1 Kinetic constants of GDH and PDOR ordered BiBi reaction

利用數(shù)學(xué)工具軟件(Maple 7.0)分別對GDH、PDOR動力學(xué)微分方程進行數(shù)值積分求解(設(shè)甘油、3-HPA初始濃度為20 mmol/L，GDH、PDOR酶量相等)，計算結(jié)果如圖6、圖7所示。由這兩個圖可知在分批反應(yīng)中，GDH催化的氧化反應(yīng)速度遠(yuǎn)小于PDOR催化的還原反應(yīng)速度，如果兩個偶合反應(yīng)同時進行，GDH氧化反應(yīng)將成為限速反應(yīng)，而輔酶 I將主要以氧化型 NAD+形式存在。若要提高偶合酶系的反應(yīng)速度，可考慮加大GDH酶量。

圖6 分批操作條件下甘油、二羥基丙酮變化的模型計算值Fig.6 Model values of variation of glycerol and DHA in batch mode.

圖7 分批操作條件下3-HPA、1,3-PD變化的模型計算值Fig.7 Model values of variation of 3-HPA and 1,3-PD in batch mode.

3 結(jié)語

本研究主要對克雷伯桿菌甘油轉(zhuǎn)化1,3-PD代謝途徑中2個關(guān)鍵酶GDH、PDOR反應(yīng)機制和動力學(xué)進行了研究。確定了GDH、PDOR雙底物酶促反應(yīng)機制為有序 BiBi，明確了由反應(yīng)物消耗到產(chǎn)物生成之間的歷程。并對有序BiBi動力學(xué)參數(shù)求解，建立了GDH、PDOR雙底物酶促反應(yīng)動力學(xué)模型。動力學(xué)信息的提供加深了克雷伯桿菌轉(zhuǎn)化1,3-PD胞內(nèi)伴有輔酶再生的酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的理解，為今后代謝工程手段分子育種或是胞外酶法合成1,3-PD的操作提供了指導(dǎo)。

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Kinetic mechanisms of glycerol dehydrogenase and 1,3-propanediol oxidoreductase from Klebsiella pneumoniae

Hongwen Chen, Jinfeng Nie, Guo Chen, and Baishan Fang
Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Fujian Province, Huaqiao University, Xiamen 361021, China

Received:September 25, 2009;Accepted:November 2, 2009

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2006AA020103), National Natural Science Foundation of China(No.20676048), Natural Science Foundation of Fujian Province(No.D0810015), New Century Excellent Talents in Fujian Province University(No.07FJRC03).

Corresponding author:Baishan Fang.Tel: +86-592-2185869; Fax: +86-592-2184822; E-mail: fangbs@hqu.edu.cn國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2006AA020103)，國家自然科學(xué)基金項目(No.20676048)，福建省自然科學(xué)基金項目(No.D0810015)，福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(No.07FJRC03)資助。