雞氨肽酶N的高效可溶性表達(dá)及生物學(xué)功能分析

尹鑫，劉瀾瀾，賈瑩，明曉波，張穎，李甜甜，魏萍

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030

雞氨肽酶N的高效可溶性表達(dá)及生物學(xué)功能分析

尹鑫，劉瀾瀾，賈瑩，明曉波，張穎，李甜甜，魏萍

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030

本研究旨為克隆雞氨肽酶 N(chAPN)基因，高效表達(dá)可溶性目的蛋白，并測定其生物學(xué)功能。應(yīng)用 RT-PCR方法從雞胚腎細(xì)胞中克隆chAPN的基因片段，經(jīng)測序鑒定后再克隆至原核表達(dá)載體pCOLD-TF，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pCOLD-TF-chAPN，在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)不同條件誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；利用鎳柱親和層析法純化可溶性蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE、Western blotting鑒定；Leu-PNA酶促反應(yīng)和ELISA等方法檢測目的蛋白生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pCOLD-TF-chAPN在大腸桿菌中以可溶形式高效表達(dá)；酶促反應(yīng)及ELISA結(jié)果顯示該蛋白具有酶活性，可結(jié)合傳染性支氣管炎病毒(IBV)，并表現(xiàn)為劑量依賴性。這為今后研究chAPN的酶活性、作為IBV受體及抗病毒功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

雞氨肽酶N，可溶性，酶活性

Abstract:To clone and express the gene encoding chicken aminopeptidase N(chAPN), and analysis the biological function of chAPN expressed inEscherichia coli(E.coli).The chAPN gene was amplified by RT-PCR from the kidney cells of chicken embryo and then cloned into the prokaryotic expression vector pCOLD-TF.Recombinant expression plasmid of pCOLD-TF-chAPN was constructed and then transformed into the competentE.coliBL21(DE3)cells for expression under different conditions such as induction time and inductor concentrations.Purified soluble recombinant chAPN was obtained by Ni-NTA His Bind Resin affinity chromatography and identified by SDS-PAGE gel and Western blotting assay.Its biological function was detected by its reaction with Leu-PNA and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA).The results showed that the expression product of chAPN gene inE.coliwas soluble.It was able to bind infectious bronchitis virus(IBV)dose-dependently.In conclusion, chAPN gene has been successfully cloned and expressed inE.coli, which will establish a basis for further research the enzymatic activity and antiviral function.

Keywords:chAPN, solubility, enzymatic activity

氨肽酶N(APN)，是一種Ⅱ型金屬蛋白酶，主要分布于腎、小腸、呼吸道上皮細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血腦屏障處的腦外膜細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸膜等處[1-2]，具有促進(jìn)血管生發(fā)[3]、酶解多肽、充當(dāng)病毒細(xì)胞受體、介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]等多種生物學(xué)功能。在冠狀病毒屬中，APN可作為多種病毒的細(xì)胞受體[4]，如豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)[5]、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)[6]、貓冠狀病毒(FCoV)[7]、犬冠狀病毒(CCoV)[6]及人冠狀病毒(HCoV-229E)[8]等的受體。研究表明，雞氨肽酶 N(chAPN)可作為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的細(xì)胞受體[9]，同時(shí)在雞胚發(fā)育過程發(fā)揮重要作用[10]。而國內(nèi)外未見該蛋白高效可溶性表達(dá)，對其生物學(xué)功能研究也極少。本研究成功擴(kuò)增了chAPN的全基因，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pCOLD-TF-chAPN，實(shí)現(xiàn)了chAPN的高效、可溶性表達(dá)，并探討了表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能，為今后進(jìn)一步開展相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 毒株、菌株、質(zhì)粒及血清

IBV M41株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉勝旺研究員饋贈；pCOLD-TF由本研究室保存；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)由本研究室保存；兔抗IBV M41血清由本研究室制備保存。

1.1.2 主要儀器與試劑

fast 200 總 RNA提取試劑盒購于 Fastgene公司；Wizard Purification Plasmid DNA Purification System 購自Promega公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購于寶泰克公司；氨芐青霉素購于Amersco公司；IPTG(Dioxane free)、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、Oligo(dT)18、dNTPs、RNase Inhibitor、pMD 18-T Simple 載體、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、SalⅠ等均購于 TaKaRa公司；蛋白純化試劑盒購于Novagen公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG購于Sigma公司。

1.1.3 引物

根據(jù) GenBank上已登錄的雞氨肽酶 Ey序列(Accession No.D87992)及pCOLD-TF多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物如下：chAPN-Up：5′-GAATTC ATGGCAG CCGGCTTCTTCAT-3′(下劃線處為 EcoRⅠ酶切位點(diǎn))；chAPN-Down：5′-GTCGAC GGCTAGCTGGAGG CGGTCTC-3′(下劃線處為 SalⅠ酶切位點(diǎn))，用以擴(kuò)增chAPN基因序列。引物由上海生工有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增目的片段為2906 bp。

1.1.4 雞胚

18 d雞胚購于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)孵化場。

1.2 chAPN基因的克隆與鑒定

1.2.1 雞胚腎組織的處理及總RNA提取

無菌采集18 d雞胚腎組織，液氮研磨后，按照Fastgen公司fast 200總RNA提取試劑盒說明書上的操作方法提取總RNA。

1.2.2 chAPN cDNA第一鏈的合成

取 10 μL 上述提取的 RNA 與 2 μL Oligo(dT)18，混勻，65℃水浴10 min，立即置冰上2 min。然后加入 4 μL 5×buffer，2 μL dNTP Mix，1 μL RNase Inhibitor，1 μL M-MLV，共 20 μL 體系，混勻，42℃水浴60 min，得到cDNA，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 chAPN全長基因擴(kuò)增

以上述合成的 cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增chAPN基因片段。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min ；94℃50 s，61.6 ℃ l min ，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72℃20 min。反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 chAPN基因的克隆

將PCR產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后與 pMD 18-T Simple載體連接，轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB平板(AMP抗性)過夜培養(yǎng)篩選，挑選單菌落，振蕩培養(yǎng)后用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，PCR和 EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切及EcoRⅠ單酶切鑒定均為陽性的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，進(jìn)一步測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為PMD 18-T-chAPN。

1.3 chAPN原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

EcoRⅠ和 Sal Ⅰ雙酶切陽性重組質(zhì)粒 PMD 18-T-chAPN，切出chAPN目的基因，同時(shí)用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切pCOLD-TF空載體；經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收 chAPN目的基因和pCOLD-TF空載體部分；在T4 DNA連接酶作用下16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Amp的LB 平板，37℃培養(yǎng)箱過夜，挑取單菌落，振蕩培養(yǎng)后用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定及EcoR I單酶切、EcoR I/Sal I雙酶切鑒定，鑒定均為陽性的質(zhì)粒送 TaKaRa公司測序，進(jìn)一步測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pCOLD-TF-chAPN。

1.4 chAPN的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

將測序正確的陽性表達(dá)重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，隨機(jī)挑取Amp抗性單菌落，接種于5 mL含Amp的LB和SOC培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1：100比例接種于10 mL含Amp新鮮LB和SOC培養(yǎng)基，37℃劇烈振搖至菌液OD600為0.5～0.7，15℃預(yù)冷培養(yǎng)物30 min后，加入終 濃 度 為 0.1～2.0 mmol/L 的 Isopropylthio-β-D-galactoside(IPTG)，15℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，分別于4、8、12、24、36、48 h取等量菌液，4℃、5000 r/min離心10 min，收集菌體。于冰浴中超聲波破碎菌體，超聲時(shí)間10 s，間隔時(shí)間10 s，功率300 W，破碎10 min。裂解菌液于4℃、12 000 r/min離心10 min，取等量上清液和沉淀，進(jìn)行8% SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色，觀察蛋白表達(dá)結(jié)果。Bandscan軟件分析不同誘導(dǎo)表達(dá)條件下目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 chAPN表達(dá)產(chǎn)物的親和純化

取3 g誘導(dǎo)表達(dá)菌用20 mL的非變性純化裂解液超聲破碎，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白純化。層析柱預(yù)先用Binding Buffer平衡10倍柱體積，上樣后用Binding Buffer洗至基線，然后用 6倍柱體積的 Wash Buffer(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，80 mmol/L 咪唑，pH 7.9)洗去非特異吸附蛋白，最后以Elute Buffer(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，1 mol/L 咪唑，pH 7.9)洗脫特異性結(jié)合的融合蛋白，收集洗脫液。純化目的蛋白經(jīng)蛋白純化儀脫鹽處理后，將其超濾濃縮，以Bradford法蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，即得到最終的目的蛋白。利用8% SDS-PAGE電泳檢測純化產(chǎn)物。

1.6 Western blotting分析

取純化的重組蛋白樣品作SDS-PAGE分析，將凝膠內(nèi)蛋白條帶轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜上，用5%脫脂奶粉 4℃封閉過夜后，將膜放置于鼠抗 His單抗(1∶2000)中，37℃溫育2 h；再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5000)于37℃孵育60 min，DAB避光顯色。

1.7 氨肽酶活性的測定

參照Blackmon等[11]的方法。取1 mL不同稀釋濃度的純化目的蛋白，加入1 mL Tris-NaCl Buffer，50 μL Leu-PNA中，37℃水浴 1 h，再加入 0.1 mL 0.4 mol/L Na2CO3使反應(yīng)終止，在410 nm波長下測定各測定管的吸光度值(OD410)，同時(shí)取1 mg蛋白質(zhì)所在相同的體積加入1 mL Tris-NaCl Buffer，50 μL Leu-PNA，0.1 mL 0.4 mol/L Na2CO3作為標(biāo)準(zhǔn)液，每次試驗(yàn)至少重復(fù)測定3次，以3次平行試管的算術(shù)平均值表示，比較不同濃度表達(dá)蛋白與Leu-PNA反應(yīng)后OD410的差異性。

1.8 ELISA檢測chAPN與IBV的結(jié)合能力

用不同稀釋度的純化目的蛋白包被酶標(biāo)板，4℃包被16 h，PBST洗滌3次；經(jīng)1% BSA于37℃封閉30 min后加入倍比稀釋IBV尿囊液進(jìn)行方陣滴定，37℃孵育60 min；加入兔抗IBV多抗血清(1∶8000)，37℃孵育60 min，洗滌后加入新鮮稀釋的酶標(biāo)羊抗兔IgG，37℃孵育60 min，TMB顯色后檢測450 nm波長OD值，同時(shí)設(shè)陰性對照及空白對照。

2 結(jié)果

2.1 chAPN全長基因的克隆和鑒定

利用合成引物以雞胚腎細(xì)胞的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD 18-T Simple載體中，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在2906 bp處有特異性的單一條帶(圖1)，與預(yù)期大小一致，將該chAPN基因序列提交GenBank(Accession No.GU223212)。

2.2 chAPN基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以 EcoRⅠ和 SalⅠ雙酶切含有 chAPN基因的pMD 18-T Simple，回收目的基因片段，插入pCOLD-TF載體的相同酶切位點(diǎn)獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pCOLD-TF-chAPN，以重組質(zhì)粒進(jìn)行 EcoRⅠ單酶切、EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果得到長約2906 bp的片段(圖2)，陽性克隆測序并分析后證實(shí)基因插入位置、方向、讀碼框均正確。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定及可溶性分析

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在約160 kDa處出現(xiàn)特異性目的條帶，大小與預(yù)期相符，而空菌及空載體對照無此特異性條帶(圖3)；經(jīng)蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90%以上以可溶形式表達(dá)(圖4)。

2.4 chAPN非變性純化及Western blotting檢測

菌體裂解上清液中融合蛋白經(jīng)親和層析純化后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，出現(xiàn)160 kDa的蛋白帶，與預(yù)期蛋白的大小一致(圖5)，經(jīng)凝膠薄層掃描分析，其純度大于 95%。經(jīng) Bradford法定量純化的chAPN蛋白濃度為4.8 mg/mL。Western blotting分析鑒定，顯示獲得良好帶 His標(biāo)簽?zāi)康牡鞍?，表明獲得高表達(dá)量的目的蛋白(圖6)。

圖1 雞氨肽酶N重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant chicken aminopeptidase N plasmid.M: DNA marker; 1: identification of the recombinant chAPN plasmid by PCR; 2: pMD18-T-chAPN digested withEcoR I; 3: pMD18-T-chAPN digested withEcoR I andSalI.

圖2 pCOLD-TF-chAPN表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定Fig.2 Construction and identification of the recombinant pCOLD-TF-chAPN.M: DNA marker; 1: PCR identification of pCOLD-TF-chAPN; 2: pCOLD-TF-chAPN digested withEcoR I;3: pCOLD-TF-chAPN digested withEcoR I andSalI.

圖3 SDS-PAGE分析雞氨肽酶N在pCOLD-TF表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant chAPN in pCOLD-TF system.M: protein marker; 1: whole fraction of recombinants with pCOLD-TF-chAPN; 2–3: the supernatant of sonicated recombinants with pCOLD-TF-chAPN; 4: control; 5:the supernatant of sonicated recombinants with pCOLF-TF.

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析Fig.4 Solubility analysis of the expressed product.M: protein molecular weight marker; 1–2: sediment of sonicated recombinants with pCOLD-TF-chAPN; 3–4: supernatant of sonicated recombinants with pCOLD-TF-chAPN.

圖5 SDS-PAGE分析Ni-NTA親和層析純化的雞氨肽酶NFig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant chAPN.M: protein marker; 1: the purified recombinant chAPN.

2.5 不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)量分析

SDS-PAGE電泳分析不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)量，通過Bandscan軟件分析目的蛋白表達(dá)相對量，結(jié)果顯示：pCOLD-TF-chAPN BL21(DE3)在SOC培養(yǎng)基中，IPTG終濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為24 h時(shí)目的蛋白產(chǎn)量最高(圖7、8)。

2.6 蛋白酶活性的測定

氨肽酶N可特異性作用于Leu-PNA底物，釋放出黃色的對硝基苯胺，在410 nm下有最大吸光度。結(jié)果顯示，隨著表達(dá)蛋白濃度梯度性的變化，OD410也呈現(xiàn)梯度性變化(圖9)，結(jié)果表明，表達(dá)蛋白具有酶活性。

2.7 ELISA檢測結(jié)果

圖6 Western blotting鑒定雞氨肽酶NFig.6 Western blotting analysis of recombinant chAPN.1: the purified recombinant chAPN reacted with anti-His mAb; M:protein marker.

圖7 不同誘導(dǎo)時(shí)間目的蛋白表達(dá)相對量Fig.7 Relative yield of the recombinant chAPN in different stages.

圖8 不同IPTG濃度目的蛋白表達(dá)相對量Fig.8 The relative yield of recombinant chAPN in different concentrations of IPTG.

圖9 不同稀釋度的雞氨肽酶N酶活性測定結(jié)果Fig.9 Enzymatic activity of the expressed chAPN at different dilution rates.

用不同濃度的chAPN包被酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)立陰性對照與空白對照，結(jié)果表明，表達(dá)目的蛋白與IBV具有較好的結(jié)合能力，P/N值均大于 3，證明了chAPN作為IBV 受體的可能性。方陣滴定顯示，最佳純化目的蛋白稀釋濃度為1∶640，最佳病毒稀釋濃度為1∶1600。

3 討論

雞氨肽酶N是一種Ⅱ型金屬蛋白酶，Ichishima等從雞卵黃中分離到，并將其命名為氨肽酶Ey[12]。Sihn等研究證明chAPN在雞胚胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[10]，目前研究表明，chAPN可介導(dǎo)雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)感染非易感細(xì)胞，可能作為IBV的功能性受體[13]；本研究從雞胚腎組織中克隆到表達(dá)chAPN的全長大小約2906 bp的目的基因，經(jīng)PCR及酶切鑒定陽性后測序結(jié)果與公布序列符合率達(dá)99.48%，為深入研究chAPN的生物學(xué)功能創(chuàng)造了條件。

明曉波及陳漢陽利用pET-28a、pET-32a原核表達(dá)載體表達(dá)了chAPN，但是表達(dá)的融合蛋白主要以包涵體形式存在，需對包涵體成分進(jìn)行繁瑣的變性復(fù)性處理，而且活性蛋白回收率低[13-14]。本研究選用pCOLD-TF低溫調(diào)控原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，由于pCOLD-TF帶有可溶標(biāo)簽TF(Trigger factor)，能促使融合蛋白最大限度地以可溶形式存在，同時(shí)該原核表達(dá)載體帶有冷休克蛋白A(Cold shock protein A)，能使重組菌在15℃條件下低溫誘導(dǎo)表達(dá)，在該條件下，非目的蛋白表達(dá)受到抑制，而融合蛋白的表達(dá)量、純度、活性得到相應(yīng)的提高。本研究通過摸索優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，如IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基等，提高了目的蛋白的表達(dá)量。

Leu-PNA酶促反應(yīng)結(jié)果顯示，該表達(dá)蛋白具有酶活性，呈現(xiàn)劑量依賴性，但chAPN的性質(zhì)(最適溫度、最適pH值、最適底物濃度、金屬離子等)對酶活性的影響有待進(jìn)一步研究。Miguel等認(rèn)為貓氨肽酶N可能作為IBV的受體[15]，但Victor等否定了前者的結(jié)論[16]。目前研究顯示，chAPN可作為IBV的功能性受體，為了進(jìn)一步驗(yàn)證 chAPN 作為 IBV功能性受體的可能性，本研究通過體外結(jié)合試驗(yàn)檢測chAPN與IBV結(jié)合能力，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，顯示chAPN能夠特異性結(jié)合IBV，且存在劑量依賴性，這與陳漢陽[14]的結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明chAPN是IBV功能性受體之一。chAPN及其抗體的抗病毒活性，chAPN是否可作為其他冠狀病毒的功能性受體，其是否與不同血清型的IBV的組織嗜性存在一定的關(guān)系，將有待進(jìn)一步研究。本研究選用 pCOLD-TF原核表達(dá)載體高效表達(dá)了chAPN，對該誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了摸索；對表達(dá)蛋白的酶活性、生物學(xué)功能進(jìn)行了探討，為進(jìn)一步研究chAPN的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1]Albiston AL.Membrane bound members of the M1 family: more than aminopeptidases.Protein Pept Lett,2004, 11: 491?500.

[2]Jeffery CJ.Moonlighting proteins: old proteins learning new tricks.Trends Genet, 2003, 19: 415?417.

[3]Fukasawa K, Hideji F, Yurka S,et al.Aminopeptidase N(APN/CD13)is selectively expressed in vascular endothelial cells and plays multiple roles in angiogenesis.Cancer Lett, 2006, 243: 135?143.

[4]Paul SM.The molecular biology of coronavirues.Adv Virus Res, 2006, 66: 193?292.

[5]Delmas B, Gelfi J, Haridon R,et al.Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.Nature, 1992, 357: 417?420.

[6]Hegyi A, Kolb AF.Characterization of determinants involved in the feline infectious peritonitis virus receptor function of feline aminopeptidase N.Gen Virol, 1998, 79:1387?1391.

[7]Tresnan DB, Levis R, Holmes KV.Feline aminopeptidase N serves as a receptor for feline, canine, porcine, and human coronaviruses in serogroup I.Virol, 1996, 70:8669?8674.

[8]Nomura, R.Human coronavirus 229E binds to CD13 in rafts and enters the cell through caveolae.Virol, 2004, 78:8701?8708.

[9]Zeng XW.Analysis on the diversity of tissue tropism of IBV strains and studies on IBV induces apoptosis.Harbin:Northeast Agricultural University, 2006: 79?81.曾祥偉.IBV組織嗜性差異分析及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006: 79?81.

[10]Sihn G, Savary K, Michaud A,et al.Aminopeptidase N during the ontogeny of the chick.Differentiation, 2006,74: 119?128.

[11]Blackmon DL, Watson AJ, Montrose MH.Assay of apical membrane enzymes based on fluorogenic substrates.Anal Biochem, 1992, 200: 352?358.

[12]Ichishima E, Yamagata Y, Chiba H,et al.Soluble and bound forms of aminopeptidase from hen’s egg yolk.Agric Biol Chem, 1989, 53: 1867?1872.

[13]Ming XB.Tissue quantitation and expression of chicken APN and its potentiality as IBV receptor evaluation.Harbin: Northeast Agricultural University, 2009: 30–35.明曉波.雞APN組織定量、表達(dá)及其作為IBV受體可能性評價(jià).哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009: 30?35.

[14]Chen HY.Study on infection HeLa cells by infectious bronchitis virus and identification of viral natural receptor.Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2007: 95–99.陳漢陽.雞傳染性支氣管炎病毒感染 HeLa細(xì)胞的研究及其天然受體的鑒定.武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007:95?99.

[15]Miguel B, Pharr GT, Wang C,et al.The role of feline aminopeptidase N as a receptor for infectious bronchitis virus.Arch Virol, 2002, 147: 2047?2056.

[16]Victor C, Lisa J, Jed M,et al.Feline aminopeptidase N is not a functional receptor for avian infectious bronchitis virus.J Virol, 2007, 4: 113?128.

Expression and biological function analysis of chicken aminopeptidase N

Xin Yin, Lanlan Liu, Ying Jia, Xiaobo Ming, Ying Zhang, Tiantian Li, and Ping Wei
College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

Received:October 27, 2009;Accepted:March 8, 2010

Supported by:Scientific Research Fund of Heilongjiang Provincial Education Department(No.2003fz012), Program for Innovative Research Team of Northeast Agricultural University(No.CXT-006-4-1).

Corresponding author:Ping Wei.Tel: +86-451-55190125; Fax: +86-451-55190463; E-mail: weiiping@yahoo.com.cn黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.2003fz012)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)課題(No.CXT-006-4-1)資助。

Received:September 25, 2009;Accepted:February 25, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30571745, 30972772).

Corresponding author:Junjie Xu.Tel/Fax: +86-10-63815273; E-mail: xujunjie@sina.com Wei Chen.E-mail: cw789661@yahoo.com國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Nos.30571745, 30972772)資助。