hNoc4L基因重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

王婷婷，王淑娟，嚴(yán)景華

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 中國(guó)科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

3 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

hNoc4L基因重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

王婷婷1,2，王淑娟3，嚴(yán)景華1

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 中國(guó)科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

2 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

3 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032

核糖體前體的形成和核運(yùn)輸需要多種核仁復(fù)合物的參與，hNoc4L是釀酒酵母S. cerevisiae的核仁復(fù)合物相關(guān)蛋白4的同源蛋白，并含有保守的Noc結(jié)構(gòu)域，但其功能未知。為了構(gòu)建hNoc4L基因過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將EF1α啟動(dòng)子替換原shRNA慢病毒載體pll3.7的U6啟動(dòng)子，成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體pll3.7-EF1，并進(jìn)一步得到了hNoc4L基因過(guò)表達(dá)的慢病毒載體。利用慢病毒包裝系統(tǒng)對(duì)不同物種的細(xì)胞進(jìn)行感染，以此檢測(cè)該重組慢病毒載體的包裝效率，并通過(guò)構(gòu)建的hNoc4L過(guò)表達(dá)的RAW264.7穩(wěn)定細(xì)胞系檢測(cè)了該載體的免疫原性和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染能力。結(jié)果表明成功構(gòu)建了高效、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)和免疫原性低的hNoc4L特異性表達(dá)的慢病毒載體，為進(jìn)一步研究hNoc4L蛋白在哺乳動(dòng)物核糖體生物發(fā)生中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

hNoc4L基因，慢病毒表達(dá)載體，核糖體生物發(fā)生

Abstract:Formation and nuclear export of pre-ribosomes requires many nucleolar complexes. hNoc4L which contains a conserved Noc doman is a homolog of nucleolar complex associated 4 (S. cerevisiae), but its function is completely unclear. Here, we successfully got the recombinant lentiviral vector pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag by replacing the U6 promoter in pll3.7 with EF1α promoter, and then insertedhNoc4Lto down-stream of the EF1α prompter. We determined the transduction efficiency in different mammalian cell lines based on lentiviral packaging system. Subsequently, we analyzed the immunogenicity of the recombinant lentivirus and stable expression ofhNoc4Lin RAW264.7 cells.The results showed that the recombinant lentivirus characterized a high transduction efficiency, long-term expression and low immunogenicity. Therefore, we pave the way for further identification of the biological activity of hNoc4L protein during ribosome biogenesis in mammalian.

Keywords:hNoc4Lgene, lentiviral expression system, ribosome biosynthesis

從細(xì)菌到人類所有生命的細(xì)胞中都存在著成千上萬(wàn)的核糖體，核糖體是蛋白質(zhì)的翻譯場(chǎng)所，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、組織的分化和發(fā)育十分重要。細(xì)胞的大部分物質(zhì)與能量都用于核糖體的合成，正在生長(zhǎng)的細(xì)胞中，與核糖體生物發(fā)生相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄約占整個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體系的60%以上[1]。由此可知，對(duì)核糖體生物合成的調(diào)控是細(xì)胞調(diào)控的關(guān)鍵步驟。目前，對(duì)于真核生物核糖體生物發(fā)生的基本過(guò)程已有初步的認(rèn)識(shí)，但其中詳細(xì)的機(jī)制尚不清楚，仍是一個(gè)研究熱點(diǎn)。

在真核生物中，核糖體的生物發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜和協(xié)同進(jìn)行的過(guò)程，發(fā)生在不同的亞細(xì)胞器中，需要3種RNA聚合酶共同協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄上百個(gè)基因，其中包括核仁區(qū)的 RNA聚合酶Ⅰ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的pre-rRNA，細(xì)胞質(zhì)中的RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的核糖體蛋白基因以及細(xì)胞核內(nèi)的 RNA聚合酶Ⅲ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的5S rRNA[2]。對(duì)酵母的研究發(fā)現(xiàn)，核糖體的生物發(fā)生主要在核仁里，后期的成熟過(guò)程是在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的，主要為pre-rRNA經(jīng)過(guò)多種剪切、修飾等步驟加工為成熟的 18S、5.8S和28S rRNA，與進(jìn)入核仁的5S rRNA以及來(lái)自細(xì)胞質(zhì)的多種相關(guān)蛋白質(zhì)相結(jié)合，組裝成核糖體的大小亞基的前體，再分別轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步成熟，組裝成有功能的核糖體[3-4]。

在核糖體的大小亞基的組裝、運(yùn)輸和成熟的過(guò)程中，反式調(diào)控因子發(fā)揮著十分重要的作用[5-7]，Noc(Nucleolar complex) 類蛋白復(fù)合物就是新發(fā)現(xiàn)的影響核糖體成熟和核運(yùn)輸?shù)闹匾姆词秸{(diào)控因子。Noc類蛋白是一類核仁復(fù)合物相關(guān)蛋白，在以酵母為模式生物的研究中發(fā)現(xiàn)，Noc1、Noc3和Noc4均有一個(gè)由45個(gè)氨基酸組成的保守的Noc結(jié)構(gòu)域[8-9]，其中Noc1-Noc2和Noc3-Noc2異源二聚體在60S核糖體前體的成熟和出核運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用，而Noc4-Nop14 (Nucleolar protein 14) 異源二聚體在40S核糖體前體的成熟和核運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用[9]。hNoc4L(Human nucleolar complex associated 4 homolog)，人核孔復(fù)合物蛋白4同源體，NCBI編號(hào)為Homo sapiens (mRNA，MGC3162)，其編碼產(chǎn)物為516個(gè)氨基酸組成的多次跨膜蛋白hNoc4L，與酵母 Noc4有相同的保守的 Noc結(jié)構(gòu)域，但其功能尚未有研究報(bào)道。因此本文構(gòu)建了hNoc4L基因特異性表達(dá)的慢病毒載體，該重組病毒能感染小鼠成纖維細(xì)胞 NIH3T3、猴腎細(xì)胞 Marc145、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和狗腎細(xì)胞 MDCK，并得到了穩(wěn)定表達(dá)hNoc4L基因的 RAW264.7細(xì)胞株，檢測(cè)了重組病毒的感染效率及免疫原性，為后續(xù)研究 hNoc4L蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株

人胚腎細(xì)胞293T、猴腎細(xì)胞Marc145、狗腎細(xì)胞MDCK、小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2菌種與載體

大腸桿菌 DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pEF-BOS、pcDNA3.0-hNoc4L-Flag為本實(shí)驗(yàn)室保存，shRNA慢病毒載體 pll3.7、包裝質(zhì)粒 pLP1、pLP2和pLP/VSVG由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所高斌研究員惠贈(zèng)。pMD-18T載體購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3工具酶及其他

DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑PEI購(gòu)自ROCHE公司，Polybrene購(gòu)自INTROVIGEN公司；去內(nèi)毒素超純質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)公司，DNA凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEG公司，完全培養(yǎng)基為含10%胎牛血清 (FBS) 的DMEM培養(yǎng)基，為GIBCO產(chǎn)品；小鼠IL-6和TNF-α ELISA預(yù)包被試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建[10]

真核表達(dá)載體 pll3.7-EF1的構(gòu)建：首先，PCR獲得EF1α啟動(dòng)子全序列，即以pEF-BOS為模板，以 F1、R1為引物擴(kuò)增 EF1α啟動(dòng)子全序列。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，16℃保溫5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并分離產(chǎn)物，應(yīng)用OMEG公司的DNA凝膠回收試劑盒回收并純化EF1α啟動(dòng)子片段，目的片段大小約1 200 bp。用T4 DNA連接酶將目的片段連接到pMD-18T載體上并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定正確后，進(jìn)行測(cè)序。用XbaI和XhoI對(duì)質(zhì)粒pll3.7雙酶切以切除U6啟動(dòng)子，凝膠電泳回收純化pll3.7的片段。酶切后pll3.7的大小約為 7 100 bp。同樣的方法對(duì)質(zhì)粒 pMD-18T-EF1α進(jìn)行雙酶切，回收EF1α片段。將兩者用T4 DNA連接酶連接，對(duì)所得克隆進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pll3.7-EF1，構(gòu)建結(jié)構(gòu)圖見圖 1。所用引物如下(5′?3′)：F1: GCTCTAGAC GTGAGGCTCCGGTGCCCGTC；R1: CCGCTCGAG TCACGACACCTGAAATGGAA。

重組表達(dá)載體pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag的構(gòu)建：用XhoI和NotI對(duì)質(zhì)粒 pll3.7-EF1和 pcDNA3.0-hNoc4L-Flag進(jìn)行雙酶切，DNA凝膠電泳回收純化pll3.7-EF1和hNoc4-Flag-His的片段。將兩者用T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)所得克隆進(jìn)行菌液 PCR和雙酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag。

圖1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of recombinant plasmids. A: EF-1α; B: pll3.7-U6; C: hNoc4L-Flag-his.

1.2.2重組慢病毒的包裝

重組表達(dá)型慢病毒載體pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag、包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG分別用試劑盒進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素大量提取，利用 PEI法共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染主要步驟 (以10 cm培養(yǎng)皿為例)：將 18 μg質(zhì)粒 (載體和包裝質(zhì)粒各 4.5 μg) 和144 μg PEI分別溶于生理鹽水中，使其終體積均為200 μL，混勻；靜置5 min后，將兩者混合，再靜置20 min，將質(zhì)粒-PEI混合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，4～6 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基 (DMEM+ 10%FBS，下同)。轉(zhuǎn)染 24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后，收集48～72 h病毒上清。3 000 r/min低速離心15 min去除細(xì)胞碎片，短期4℃保存?zhèn)溆?，長(zhǎng)期保存則1 mL分裝，于?80℃保存。

1.2.3重組病毒感染不同來(lái)源的細(xì)胞

將293T細(xì)胞接種于6孔板中，以培養(yǎng)24 h后細(xì)胞密度達(dá)到 30%～40%為宜。移去培養(yǎng)基，加入收集的病毒上清1 mL，補(bǔ)加1 mL新鮮的完全培養(yǎng)基，并加入Polybrene，使其終濃度為8 μg/mL，感染8 h后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基。感染48 h后熒光顯微鏡下觀察是否可見綠色熒光。病毒成功包裝后，同樣方法分別感染Marc145、MDCK、NIH3T3和RAW264.7細(xì)胞，并于48 h后觀察感染情況。

1.2.4過(guò)表達(dá)hNoc4L的RAW264.7穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建

將假病毒感染的 RAW264.7細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，得到hNoc4L基因過(guò)表達(dá)的多克隆細(xì)胞。將得到的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測(cè)靜息狀態(tài)下的不同 RAW264.7細(xì)胞株的細(xì)胞因子分泌情況，具體檢測(cè)方法見1.2.5。培養(yǎng)30 d后，在熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定細(xì)胞株的陽(yáng)性情況，并通過(guò) Western blotting檢測(cè)hNoc4L基因的表達(dá)情況。

1.2.5ELISA法檢測(cè)RAW264.7穩(wěn)定克隆株的細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的分泌

本過(guò)程中使用的是達(dá)科為生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的ELISA預(yù)包被減步法試劑盒，原理為雙抗體夾心法。步驟為：將104個(gè)細(xì)胞接種于48孔板，每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)8 h后收集細(xì)胞上清，按照試劑盒的要求進(jìn)行操作。以試劑盒配備的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 (0 pg/mL、31.25 pg/mL、62.5 pg/mL、125 pg/mL、250 pg/mL和500 pg/mL)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞上清中 IL-6和 TNF-α的含量。以加入100 ng/mL LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.6Western blotting檢測(cè)目的基因hNoc4L的表達(dá)情況

用裂解緩沖液 (0.5% NP-40的PBS，含蛋白酶抑制劑混合物) 裂解細(xì)胞，離心取上清，加入上樣緩沖液 (含DTT)，100℃處理5 min；各取15 μL上樣進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳 (80 V，30 min；120 V，1 h)；轉(zhuǎn)膜 (200 mA，1 h)；含5%脫脂奶粉的TBS封閉1 h，加入含有anti-Flag (1∶1 000) 的封閉液搖動(dòng)1～2 h；用 TBST (含0.5‰ Tween-20) 洗 3次；用含有IgG-HRP (1∶5 000) 的封閉液搖動(dòng)1 h；用TBST洗3次；將膜晾干，加顯色液于膜上，用封口膜將膜包住放入暗盒內(nèi)，加入X光膠片，進(jìn)行曝光、顯影和定影。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體pll3.7-EF1以及hNoc4L基因特異性表達(dá)的重組慢病毒載體的構(gòu)建與表達(dá)：

以pEF-BOS為模板，將PCR擴(kuò)增出的EF1α片段插入到pMD-18T載體上，雙酶切得到的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，回收目的片段，在將其插入到 pll3.7載體的XbaI和XhoI之間，所挑取的克隆經(jīng)XbaI和XhoI雙酶切鑒定，切出約1 184 bp的條帶，構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體pll3.7-EF1經(jīng)測(cè)序鑒定正確。以pcDNA3.0-hNoc4L-Flag為模板酶切出的hNoc4L-Flag-his6片段插入到pll3.7-EF1α的XbaI和XhoI之間，所挑的陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切得到約1 592 bp的片段，與目的片段大小相符，且測(cè)序正確。由于pll3.7-EF1-hNoc4LFlag包含有由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的GFP基因，因此，可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率及重組病毒的感染效率。將構(gòu)建成功的載體用PEI法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后，在熒光顯微鏡下能觀察到大部分細(xì)胞都被成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，收集已成功轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，并通過(guò)Western blotting檢測(cè)到hNoc4L基因的成功表達(dá)(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建與表達(dá)鑒定Fig.2 The construction and expression of recombinant plasmids. (A) Double digestion of recombinant plasmids pll3.7-EF1 (M1:marker DL2000; M2: marker 1 kb DNA ladder; 1?5: five repeats). (B) pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag (M1: marker DL2000; M2: marker 1 kb DNA ladder; 1?3: three repeats). (C) Transfecting pll3.7-EF1-hNOC4L-Flag in 293T cells. (D) Western blotting analyze ofhNOC4Lgene (lane 1: pll3.7-EF1 in 293T cells; lane 2: pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag in 293T cells).

2.2 重組慢病毒的包裝及鑒定

將重組表達(dá)型慢病毒載體 pll3.7-EF1-hNoc4LFlag和病毒包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，且轉(zhuǎn)染效率較高 (數(shù)據(jù)未顯示)。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，72 h后收集病毒上清，并感染293T細(xì)胞，將已感染的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說(shuō)明重組慢病毒已成功生產(chǎn) (圖 3)。將同一視野自然光和熒光下的圖片進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，重組慢病毒載體可以高效感染293T細(xì)胞。

圖3 重組慢病毒對(duì)不同細(xì)胞的感染后觀察EGFP的表達(dá)Fig.3 EGFP expression after transducing recombinant lentiviral construct into the mammalian cell lines of choice under light microscope and fluorescence microscope.

2.3 慢病毒假病毒對(duì)不同細(xì)胞的感染結(jié)果

近年來(lái)，一些研究表明，索氏的“語(yǔ)言”實(shí)際上是科學(xué)主義的產(chǎn)物[20-21]。所謂科學(xué)主義，是指主張把自然科學(xué)的方法應(yīng)用于人文社會(huì)科學(xué)在內(nèi)的一切研究領(lǐng)域的觀點(diǎn)?？茖W(xué)研究往往需要去除各種“雜質(zhì)”的影響，索緒爾的語(yǔ)言學(xué)理論中含有科學(xué)主義的因素，他提出的變革方法就是要開展一場(chǎng)“同質(zhì)化”運(yùn)動(dòng)”[22]364。這里我們有必要深究?jī)蓚€(gè)問(wèn)題：(1)社會(huì)科學(xué)為什么要去除雜質(zhì)，開展同質(zhì)化運(yùn)動(dòng)？(2)社會(huì)科學(xué)是如何去除雜質(zhì)，達(dá)到同質(zhì)化這一目的的？

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)重組慢病毒表達(dá)載體對(duì)不同細(xì)胞的感染情況，用收集的病毒分別感染 4種不同物種來(lái)源的細(xì)胞系：猴腎細(xì)胞 Marc145、狗腎細(xì)胞MDCK、小鼠成纖維細(xì)胞 NIH3T3和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7。感染 48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)這 4種細(xì)胞均可見綠色熒光 (圖 3)，說(shuō)明包裝出的慢病毒能成功感染目標(biāo)細(xì)胞，其中 Marc145、MDCK及 NIH3T3細(xì)胞有較高的感染效率，而RAW264.7細(xì)胞感染效率較低。

2.4 過(guò)表達(dá)hNoc4L基因的 RAW264.7穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建以及細(xì)胞特性的鑒定

感染重組病毒的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)過(guò)3周的培養(yǎng)后，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選，得到了hNoc4L基因過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系 (圖4)。RAW264.7細(xì)胞是小鼠巨噬細(xì)胞系，有外界刺激時(shí)會(huì)釋放大量的炎癥因子。為了了解病毒感染 RAW264.7細(xì)胞是否會(huì)引起細(xì)胞強(qiáng)烈的免疫原性，我們用ELISA法檢測(cè)了RAW264.7細(xì)胞及 hNoc4L過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系靜息狀態(tài)的細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的分泌情況 (表1)。結(jié)果顯示，與沒有感染病毒的RAW264.7細(xì)胞相比，重組慢病毒感染的 RAW264.7細(xì)胞 (包括 RAW264.7-pll3.7-EF1及 RAW264.7-pll3.7-EF1-hNoc4L-Flag) 的 TNF-α 和IL-6的含量都沒有升高，表明構(gòu)建的重組病毒沒有引起 RAW264.7細(xì)胞發(fā)生明顯的免疫反應(yīng)。為了檢測(cè)hNoc4L基因在細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)情況，我們將上述細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)30 d后收集該細(xì)胞，用Flag抗體檢測(cè)hNoc4L蛋白的表達(dá)，在約57 kDa大小處檢測(cè)到特征帶，符合預(yù)期大小，說(shuō)明hNoc4L基因成功地穩(wěn)定表達(dá) (圖 5)。用熒光顯微鏡觀察，同一視野自然光和熒光對(duì)比發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的陽(yáng)性率無(wú)明顯改變 (數(shù)據(jù)未顯示)。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)hNoc4L基因的RAW264.7細(xì)胞系Fig.4 Stable expression ofhNoc4Lgene in RAW264.7 cell line.

表1 ELISA檢測(cè) RAW264.7和hNoc4L穩(wěn)定細(xì)胞系的IL-6和TNF-α分泌情況Table 1 Determination of IL-6 and TNF-α of different cell lines by ELISA

圖5 Western blotting檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系中hNoc4L基因的表達(dá)Fig.5 Western blotting assay ofhNoc4Lgene in stable cell lines of RAW264.7. 1: pll3.7-EF1 in RAW264.7 cells; 2:pll3.7-EF1- hNoc4L-Flag in RAW264.7 cells.

3 討論

細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的快慢取決于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的速率，而蛋白質(zhì)合成的速率又取決于核糖體的生成和核糖體RNA基因的轉(zhuǎn)錄速率，由此可知，核糖體的生物合成對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有著決定性的作用。核糖體的生物合成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，在基因結(jié)構(gòu)水平上，核糖體RNA基因通常以多拷貝的形式存在于染色體上形成串聯(lián)重復(fù)單位序列，這些序列上還包含了一些重要的順式調(diào)控元件，配合著一些反式調(diào)控因子調(diào)控核糖體RNA基因的轉(zhuǎn)錄；在核糖體的大小亞基的成熟過(guò)程中，反式作用因子也發(fā)揮著重要的作用，如核酸酶對(duì)pre-rRNA非編碼序列的切除、SnoRNP對(duì)35S pre-RNA的假尿嘧啶化和甲基化修飾、RNA螺旋酶和RNA分子伴侶介導(dǎo)的RNP折疊和改構(gòu)、GTPase和 ATPase催化的蛋白質(zhì)的聚合和解聚合過(guò)程等[7,11-13]。在以酵母為模式生物對(duì)核糖體生物發(fā)生的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究的過(guò)程中不斷有新的發(fā)現(xiàn)。在釀酒酵母S. cerevisiae中，Noc類蛋白復(fù)合物是一類影響核糖體大小亞基裝配和核運(yùn)輸?shù)闹匾姆词秸{(diào)控因子，但其在哺乳動(dòng)物中的功能未知。因此研究Noc類蛋白在哺乳動(dòng)物的核糖體生物合成中的作用是十分重要的，本實(shí)驗(yàn)選擇了hNoc4L蛋白為研究對(duì)象。

在實(shí)驗(yàn)研究中，常用的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體等。腺病毒可以攜帶大DNA片段并能轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞，但轉(zhuǎn)染效率較低，有較高的抗原性和毒性，只能短暫表達(dá)目的蛋白[14]；而慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基于 HIV-I型病毒構(gòu)建的慢病毒載體可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細(xì)胞，能夠攜帶大片段基因，且不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，更重要的是能將目的基因高效整合到宿主細(xì)胞染色體中，不易引起插入突變，理論上能夠在細(xì)胞內(nèi)永久表達(dá)并在子代中穩(wěn)定表達(dá)[15]，而且改造后的慢病毒假病毒沒有復(fù)制能力，具有較好的生物安全性，是一種理想的基因轉(zhuǎn)移載體[16]。因此，本研究選擇慢病毒載體作為特異性表達(dá)hNoc4L基因的載體。

慢病毒載體的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是有廣泛的細(xì)胞感染譜，為了檢測(cè)我們所獲得的重組慢病毒載體的感染效果，我們感染了不同來(lái)源的細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其能高效感染來(lái)源于人、鼠、犬等不同物種的細(xì)胞系。MDCK細(xì)胞和Marc145細(xì)胞的常規(guī)轉(zhuǎn)染效率不高，約在5%～20%之間；而利用本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的載體，可以達(dá)到70%以上的陽(yáng)性率，因此使用該載體可以方便地解決不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的外源基因難以高效導(dǎo)入的問(wèn)題。

RAW264.7細(xì)胞是小鼠的巨噬細(xì)胞，當(dāng)有外界刺激時(shí)，該細(xì)胞極易分化，外形由正常狀態(tài)下的圓球形向不規(guī)則的形狀轉(zhuǎn)變，并且伴隨有炎癥因子的釋放，所以可以用來(lái)檢測(cè)我們所構(gòu)建的hNoc4L基因特異性表達(dá)載體的免疫原性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該載體通過(guò)感染進(jìn)入細(xì)胞后，并沒有引起細(xì)胞形狀的改變，也沒有造成強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。此外，RAW264.7細(xì)胞也是一種極難利用常規(guī)化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，常用的方法就是電轉(zhuǎn)，而電轉(zhuǎn)是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，成本高，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞又容易分化。我們所獲得的hNoc4L基因特異性表達(dá)的載體因其帶有EGFP標(biāo)簽，可以通過(guò) FACS分選得到陽(yáng)性細(xì)胞，又加之慢病毒載體可以通過(guò)本身具有的5′LTR和3′LTR穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中并長(zhǎng)期表達(dá)，因此免去使用抗生素篩選穩(wěn)定克隆所需的較長(zhǎng)的時(shí)間周期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，我們所獲得的穩(wěn)定細(xì)胞系能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)hNoc4L基因。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了hNoc4L基因特異性表達(dá)的重組慢病毒載體，該載體具有高效、長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)和免疫原性低的特點(diǎn)，為后續(xù)研究hNoc4L蛋白在哺乳動(dòng)物核糖體生物發(fā)生中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and identification of recombinant lentiviral vector ofhNoc4Lgene

Tingting Wang1,2, Shujuan Wang3, and Jinghua Yan1

1CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Science,Beijing100101,China
2Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China
3China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao266032,China

Received:April 23, 2010;Accepted:May 11, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30870118).

Corresponding author:Jinghua Yan. Tel: +86-10-64807569; Fax: +86-10-64807598; E-mail: yanjh@im.ac.cn

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