一株黃曲霉菌種對(duì)土壤氯嘧磺隆殘留的降解特性

韓 婷 婷， 孫 慶 元， 宗 娟， 李 陽

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

氯嘧磺隆(也稱豆磺隆)是80年代初期美國杜邦公司開發(fā)的磺酰脲類除草劑，自90年代大面積使用以來，由于其殺草譜廣、超高活性、高選擇性、可混性強(qiáng)等特點(diǎn)，一直是大豆田化學(xué)除草劑的主要品種，在土壤中主要通過水解和微生物降解作用而消失[1-2]，但磺酰脲類除草劑在土壤中殘留時(shí)間長，對(duì)后茬敏感作物易造成傷害[3]，利用微生物降解可以很好地解決氯嘧磺隆在土壤中的殘留問題。已報(bào)道的能夠高效降解氯嘧磺隆的菌株僅有：睪丸酮叢毛單胞菌、黑曲霉、青霉及酵母菌，不能滿足市場(chǎng)的需求。本文篩選馴化得到新的高效降解菌株，并對(duì)其降解氯嘧磺隆的特性進(jìn)行了研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

1.1.1 供試藥劑及培養(yǎng)基

供試藥劑：20%氯嘧磺隆可濕性粉劑(豆磺隆)，大連瑞澤農(nóng)藥股份有限公司。

富集培養(yǎng)基： 蛋白胨 0.5 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，蒸餾水100 mL。分離培養(yǎng)基[4]：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏培養(yǎng)基。其他培養(yǎng)基[4]：麥芽汁液體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

1.1.2 供試植物

玉米種子，三益種業(yè)有限公司；油菜種子，陜西榮華雜交油菜種子有限公司。

1.1.3 供試土壤

供試土壤有兩種，均為黑土:①取自大連工業(yè)大學(xué)玉山(未施用過除草劑) 0～10 cm耕層土壤；②取自黑龍江大西江農(nóng)場(chǎng)被氯嘧磺隆污染的大豆土壤。

1.2 方 法

1.2.1 降解菌的富集和篩選

1.2.1.1 降解菌的富集

取黑龍江大西江農(nóng)場(chǎng)被氯嘧磺隆污染的大豆土壤為處理對(duì)象，用無菌生理鹽水溶解后制得土壤懸濁液，在250 mL三角瓶中，參考瓶培養(yǎng)富集技術(shù)[5-7]，加入100 mL富集培養(yǎng)基(氯嘧磺隆的質(zhì)量濃度為100 mg/L)，按5%的接種量接種土壤懸濁液，置28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)4 d后，將培養(yǎng)液按5%接種量接種于質(zhì)量濃度為200 mg/L的氯嘧磺隆中，28 ℃搖床培養(yǎng)4 d，依此類推10次接種，使最終富集培養(yǎng)液氯嘧磺隆的質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 mg/L，得到降解菌的富集種子液。

1.2.1.2 降解菌的分離純化

降解菌富集過程中，每2次轉(zhuǎn)接后，都將菌液梯度稀釋涂布于牛肉膏培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，根據(jù)生長情況不同，28 ℃培養(yǎng)2～4 d，據(jù)其不同的外觀特征挑取單菌落，反復(fù)劃線純化，根據(jù)外觀特征和顯微形態(tài)觀察的菌體形態(tài)特征合并相同的菌種，對(duì)菌種編號(hào)，將分離所得菌種進(jìn)行進(jìn)一步的氯嘧磺隆適應(yīng)性培養(yǎng)，按5%接種量接種到氯嘧磺隆質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的麥芽汁培養(yǎng)基上，所得菌種于冰箱4 ℃保存。

1.2.2 菌種鑒定

依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[8]進(jìn)行鑒定。

1.2.3 菌液的制備

將所得高效降解菌放置于PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下，120 r/min搖床培養(yǎng)2 d。

1.2.4 菌土的制備

向2 000 g過篩風(fēng)干的未施用氯嘧磺隆的滅菌黑土中加入100 mL菌液以及200 mL麥芽汁培養(yǎng)基，放置于通風(fēng)良好的培養(yǎng)箱于28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。

1.2.5 氯嘧磺隆的生物測(cè)定方法

1.2.5.1 氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物測(cè)定方法[9-10]，配制0、0.5、1、5、10、20、30、40、50 μg/kg 9個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯嘧磺隆藥土，以ln(w+1)為橫坐標(biāo)(w為氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù))，玉米主根長抑制率為縱坐標(biāo)，剔除氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 μg/kg的點(diǎn)，因?yàn)樵诖它c(diǎn)氯嘧磺隆對(duì)玉米主根起促進(jìn)作用，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=20.368x-3.571 3 (R2=0.994 3)。

1.2.5.2 降解率的計(jì)算公式

氯嘧磺隆降解率=

(1)

1.2.6 高效降解菌降解實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 土壤pH的調(diào)節(jié)

將100 g土壤溶解于250 mL無CO2蒸餾水中，攪動(dòng)1 min，放置0.5 h，此時(shí)應(yīng)避免空氣中有氨和揮發(fā)性酸，用pH計(jì)測(cè)讀pH值，再用硫酸和生石灰調(diào)節(jié)土壤pH。

1.2.6.2 土壤濕度的調(diào)節(jié)

稱量100 g土樣，放入烘箱，(105±2) ℃烘干，烘干前后的質(zhì)量差值除以烘干前的土樣質(zhì)量，即為土壤的濕度，以此為依據(jù)調(diào)節(jié)土樣的濕度。

1.2.6.3 降解能力的測(cè)定

取0～10 cm土層的黑土，風(fēng)干后過8目篩，配制成含10 μg/kg氯嘧磺隆(田間正常用量)的土樣，調(diào)節(jié)含水量至40%，調(diào)節(jié)pH為7，配好的土樣按10%接種菌土，每紙杯100 g此土樣，每處理3次重復(fù)，分別記錄各處理調(diào)節(jié)含水量后土壤總重量，每3天稱量，加水補(bǔ)足，以保持其濕度不變，28 ℃下培養(yǎng)30 d，用生物測(cè)定方法[11]測(cè)定氯嘧磺隆殘留量，計(jì)算降解率。

依此方法分別對(duì)pH、溫度、濕度、接種量、氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)作單因素試驗(yàn)，以測(cè)得最佳降解條件，調(diào)節(jié)pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，調(diào)節(jié)溫度分別為20、25、28、30、35、40 ℃，調(diào)節(jié)濕度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，分別按2%、5%、10%、15%、20%、25%接種菌土，將土樣分別配制成5、10、15、20、25、30 μg/kg氯嘧磺隆，測(cè)定不同條件下的降解率。

1.2.6.4 降解菌生物量氮的測(cè)定

采用氯仿熏蒸法，通過氯仿熏蒸，使土壤中微生物細(xì)胞破裂，采用熏蒸-浸提法測(cè)定釋放出的微生物生物量氮，用0.5 mol/L K2SO4浸提，浸提液中的氮采用凱氏消煮法測(cè)定[12]。

1.2.7 高效降解真菌的修復(fù)作用對(duì)油菜發(fā)育的影響

取0～10 cm土層的黑土，過8目篩，配制成含5 μg/kg氯嘧磺隆土樣，調(diào)節(jié)濕度至60%，調(diào)節(jié)pH為6.5，配好的土樣按10%接種菌土；同時(shí)設(shè)不加氯嘧磺隆的清水對(duì)照和加氯嘧磺隆不加菌土的對(duì)照，每花盆1 000 g此土樣，每處理3次重復(fù)，分別記錄各處理調(diào)節(jié)含水量后土壤總重量，每3天稱量，加水補(bǔ)足，以保持其濕度不變，28 ℃下培養(yǎng)35 d。將油菜種子在28 ℃溫箱中浸種24 h后再催芽20 h，待油菜種子露白后，選取芽長一致的種子播于上述土壤中，觀察油菜的出苗和生長發(fā)育情況，在7 d后測(cè)定其出苗率，在第15、25、35天對(duì)其株高，鮮重進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解氯嘧磺隆菌株的篩選及鑒定

富集培養(yǎng)并分離出了一株高效降解除草劑氯嘧磺隆的菌株，命名為Q6，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》輔助利用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)及生長特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其菌絲體發(fā)達(dá)，以分生孢子繁殖，有分隔，分生孢子球形、成鏈，分生孢子梗頂端膨大，頂囊近球形，基部有厚膜足細(xì)胞，菌落初略帶黃色，后漸變?yōu)辄S綠色，終成褐綠色。圖1為Q6在PDA培養(yǎng)基中的形態(tài)，初步鑒定為叢梗孢目叢梗孢科曲霉屬中的黃曲霉。

2.2 土壤pH對(duì)Q6生長及氯嘧磺隆降解的影響

圖2為土壤pH對(duì)Q6生長及降解氯嘧磺隆的影響。由圖2可以看出，在pH 5～5.5時(shí)，氯嘧磺隆降解率提升緩慢；在pH 5.5～6.5時(shí)，降解率快速提升，并在pH 6.5時(shí)有最大降解率，生物量氮也在pH 6.5時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)；在pH 6.5～8.0時(shí)，降解率大幅度下降，其中，在pH 6.5～7.0時(shí)，生物量氮下降較慢，在pH 7.0～8.0時(shí)，生物量氮迅速下降；Q6對(duì)氯嘧磺隆降解的最適pH為6.5，可能是因?yàn)樵趐H為6.5時(shí)，菌體生長最好，加速了氯嘧磺隆的降解。文獻(xiàn)[13]指出：除草劑降解的主要途徑為酸催化的水解作用和微生物降解，在土壤pH>6.8 時(shí)大多數(shù)長殘留磺酰脲除草劑的微生物降解和水解作用均停止，促使殘留嚴(yán)重，這也是氯嘧磺隆在酸性條件下的降解率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于堿性條件下的原因。

圖1 Q6在PDA培養(yǎng)基中的形態(tài)Fig.1 The morphous of Q6 in PDA nutritive medium

圖2 土壤pH對(duì)Q6生長及降解氯嘧磺隆的影響Fig.2 The effect of edaphic pH on growth of Q6 and chlorimuron-ethyl degradation

2.3 溫度對(duì)Q6生長及氯嘧磺隆降解的影響

圖3為溫度對(duì)Q6生長及降解氯嘧磺隆的影響。由圖3可以看出，在溫度為20 ℃時(shí)，降解率最低，生物量氮也最?。辉跍囟葹?0～28 ℃時(shí)，降解率迅速提高；在28～40 ℃時(shí)，降解率和生物量氮均緩慢下降。氯嘧磺隆降解的最適溫度為28 ℃，此時(shí)，生物量氮也最大，說明此時(shí)Q6生長旺盛，酶活性較高，低溫時(shí)降解率較低，可以看出，北方的低溫天氣不利于氯嘧磺隆的降解。

2.4 土壤濕度對(duì)Q6生長及氯嘧磺隆降解的影響

圖4為土壤濕度對(duì)Q6生長及降解氯嘧磺隆的影響。由圖4可以看出，土壤濕度為20%時(shí)，

圖3 溫度對(duì)Q6生長及降解氯嘧磺隆的影響Fig.3 The effect of temperature on growth of Q6 and chlorimuron-ethyl degradation

圖4 土壤濕度對(duì)Q6生長及降解氯嘧磺隆的影響Fig.4 The effect of edaphic humidity on growth of Q6 and chlorimuron-ethyl degradation

氯嘧磺隆的降解率最低；在土壤濕度為20%～60%時(shí)，氯嘧磺隆降解率逐漸上升，生物量氮也隨之上升；在土壤濕度為70%時(shí)又有所下降，所以，氯嘧磺隆的最適降解濕度為60%。在低濕度下，降解率較小，一方面是由于干旱條件下氯嘧磺隆容易被土壤吸附，不利于微生物的降解；另一方面可能是由于在較高濕度下有利于菌體生長，加速了氯嘧磺隆的降解。

2.5 接種量對(duì)Q6的生長及氯嘧磺隆降解的影響

圖5為接種量對(duì)Q6的生長及降解氯嘧磺隆的影響。由圖5可以看出，接種量越大，降解率越高，生物量氮也越大，但是也可以看出接種量在2%～10%時(shí)，降解率快速提高，生物量氮增長迅速；在10%～25%時(shí)，降解率有所提高，但提高不大，生物量氮的增長也有所減緩，可能是隨著接種量的提高，土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，無法滿足過量菌體的生長需要。從多方面考慮，適宜接種量為10%。

圖5 接種量對(duì)Q6的生長及降解氯嘧磺隆的影響Fig.5 The effect of inoculum size on growth of Q6 and chlorimuron-ethyl degradation

2.6 氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Q6的生長及氯嘧磺隆降解的影響

圖6為氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Q6的生長及降解氯嘧磺隆的影響。由圖6可以看出，在氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2～10 μg/kg時(shí)，降解率有所增加，在氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～30 μg/kg時(shí)，降解率又有所下降，這可能是因?yàn)槁揉谆锹∽鳛橐环N復(fù)雜的化學(xué)物質(zhì)一方面難以被直接利用而抑制微生物的生長，另一方面又提高了降解酶的活性，如果酶活性的提高大于對(duì)生長量的抑制，降解率上升;若生長量的抑制大于酶活性提高的程度，則降解率減小。總的來說，在氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2～30 μg/kg，降解率改變較小，可見，氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)降解率的影響不大，仍在10 μg/kg下有較高降解率，氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大生物量氮越小，說明氯嘧磺隆對(duì)菌體的生長有抑制作用，但隨著氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，生物量氮趨于平穩(wěn)。

圖6 氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Q6的生長及降解氯嘧磺隆的影響Fig.6 The effect of chlorimuron-ethyl concentration on growth of Q6 and chlorimuron-ethyl degradation

在pH為6.5、溫度為28 ℃、濕度為60%、接種量為10%、氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 μg/kg條件下，30 d Q6對(duì)土壤氯嘧磺隆殘留的降解率為94.88%。

2.7 Q6降解土壤氯嘧磺隆殘留對(duì)油菜生長的影響

在氯嘧磺隆處理中，油菜受害嚴(yán)重，第35天的株高只有清水對(duì)照樣中的57%，抑制率達(dá)到43%，鮮重只有清水對(duì)照的52.14%，抑制率達(dá)到了47.86%，但經(jīng)過高效降解菌處理的油菜生長量大大提高，其株高和鮮重分別為清水對(duì)照的92.27%和87.74%，說明Q6對(duì)氯嘧磺隆有很好的降解作用，如表1所示。

表1 Q6降解土壤氯嘧磺隆殘留對(duì)油菜生長的影響Tab.1 Effect of Q6 degrading chlorimuron-ethyl residues in soil on rape growth

3 結(jié) 論

高效降解菌Q6初步鑒定為叢梗孢目叢梗孢科曲霉屬中的黃曲霉；Q6能夠高效降解土壤中氯嘧磺隆，培養(yǎng)條件對(duì)微生物降解氯嘧磺隆的速率有很大影響，只有在適宜的環(huán)境條件下，微生物才能充分發(fā)揮其降解能力，Q6在土壤中最適降解pH為6.5，最適溫度為28 ℃，最適土壤濕度為60%，適宜接種量為10%，氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)氯嘧磺隆降解無顯著影響，但仍在氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 μg/kg時(shí)有較高降解率；本研究還發(fā)現(xiàn)，菌體生長和降解率有著緊密聯(lián)系，降解率達(dá)到最大時(shí)也是菌體生長的最佳值，說明Q6在生長過程中利用了氯嘧磺隆；最后通過Q6對(duì)氯嘧磺隆殘留土壤修復(fù)后種植油菜進(jìn)一步驗(yàn)證了Q6的高效降解作用。我國對(duì)氯嘧磺隆的降解研究較少，主要為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分離出的高效降解菌F8，在土壤pH為6.75，溫度為28 ℃，土壤含水量20%，接種量2%時(shí)，氯嘧磺隆質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 μg/kg，培養(yǎng)30 d的降解率達(dá)到80%，與此相比，本文的Q6也為高效降解菌。

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