納豆菌糖苷酶水解大豆異黃酮的條件優(yōu)化

蘆 明 春， 馬 素 果， 楊 紅， 王 應(yīng) 男， 羅 平

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

大豆異黃酮的健康功效多種多樣，可以預(yù)防癌癥(乳腺癌、前列腺癌等)、降低心血管疾病危險(xiǎn)、改善骨健康狀況[1]。在已知大豆異黃酮的12種異構(gòu)體中，游離型的苷元約占總量的2%～3%，包括染料木素(Genistein)、大豆苷元(Daidzein)和黃豆黃素(Glycitein)，結(jié)合型的糖苷約占總量的97%～98%[2]。多項(xiàng)研究[3-4]表明，具有生物活性的異黃酮是其苷元形式，而非糖苷形式。因此，將異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化成苷元顯得尤為重要。

目前，人們多用酸解法制取大豆異黃酮苷元，且多采用鹽酸(1～3 mol/L)和較高溫度(98～100 ℃)制取。酸水解效率高，但強(qiáng)酸會影響苷元的穩(wěn)定性[5]。所以，微生物酶法轉(zhuǎn)化[6]，即利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶將無效或低效成分變?yōu)橛行Ш透咝С煞忠鹆藦V泛的關(guān)注。關(guān)于糖苷酶水解大豆異黃酮的工作，沈玥[5]、齊斌[7]、陳慶慶[8]等對乳酸菌或黑曲霉所產(chǎn)糖苷酶及其水解大豆異黃酮進(jìn)行了研究，但是，對于納豆菌糖苷酶的研究較少。納豆作為一種發(fā)酵食品，同樣富含苷元形式的大豆異黃酮。本文利用納豆菌所產(chǎn)糖苷酶，對其水解大豆異黃酮的條件進(jìn)行優(yōu)化，為大豆異黃酮苷元的制備提供更為廣泛的途徑。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌種：納豆菌，分離自雁鳴湖納豆，吉林省雁鳴湖大豆生物科技有限責(zé)任公司(中日合資)；98%染料木素，北京中天微維生物技術(shù)有限公司；大豆，市售；大豆異黃酮，大連綠峰生物有限公司；薄層層析板silica gel 60 F254，德國Merck公司；其他試劑均為分析純或生化純。

斜面培養(yǎng)基(g/L)[9]：蛋白胨5，牛肉膏5，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.2～7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆10 g，加水量60%，浸泡10 h，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方 法

1.2.1 糖苷酶粗提液的制備

取“1.1”中的發(fā)酵培養(yǎng)基，按10%接菌量(以大豆質(zhì)量計(jì))將種子培養(yǎng)基接入其中，37 ℃培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束，按培養(yǎng)物3倍體積(以大豆質(zhì)量計(jì))加入0.02 mol/L pH 5.0的HAc-NaAc緩沖溶液，振蕩提取3 h，所得液體即為糖苷酶粗提液。

1.2.2 薄層層析(TLC)檢測大豆異黃酮轉(zhuǎn)化

一定體積的糖苷酶粗提液與大豆異黃酮溶液反應(yīng)，經(jīng)乙酸乙酯萃取，離心，取上層萃取液作薄層層析(TLC)檢測，點(diǎn)樣量為10 μL，展開劑為V(乙酸乙酯)∶V(丁酮)∶V(甲醇)∶V(水)=10∶7∶1∶1，在紫外線254 nm下觀測。

1.3 高效液相色譜法(HPLC)分析

1.3.1 色譜條件

色譜柱，C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測器，二極管陣列檢測器；波長，260 nm；體積流量，1.0 mL/min；柱溫，40 ℃；進(jìn)樣量，20 μL。流動相A為甲醇(色譜級)，流動相B為1.0%水-冰乙酸。流動相比例如表1[10]所示。

表1 HPLC的流動相條件Tab.1 Condition of mobile phase for HPLC

1.3.2 轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

不同的糖苷酶粗提液與底物大豆異黃酮反應(yīng)體系，經(jīng)乙酸乙酯萃取、離心，取上層萃取液，揮發(fā)至干。用色譜甲醇溶解析出物，進(jìn)行HPLC測定[11]。

大豆異黃酮糖苷水解率=

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 水解時(shí)間對大豆異黃酮水解的影響

在pH 5.0，溫度為40 ℃，底物質(zhì)量濃度為2 mg/mL，酶底體積比為3∶1的條件下，分別對大豆異黃酮進(jìn)行水解1、3、6、9、12 h，通過方法“1.2.2”，考察水解時(shí)間對大豆異黃酮水解的影響。

不同水解時(shí)間的結(jié)果如圖1。由圖1可知，反應(yīng)1 h的水解效果較差，隨反應(yīng)時(shí)間延長，水解效果明顯增強(qiáng)，反應(yīng)12 h的水解效果最好?？梢?，反應(yīng)3 h時(shí)，對大豆異黃酮的水解已足夠完全，故不必延長水解時(shí)間。因此，選擇水解時(shí)間為3 h。

0,底物；1～5,分別為1、3、6、9、12 h水解產(chǎn)物圖1 不同水解時(shí)間的大豆異黃酮TCL圖譜Fig.1 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of isoflavone

2.1.2 水解溫度對大豆異黃酮水解的影響

在pH 5.0、底物質(zhì)量濃度為2 mg/mL、酶底體積比為3∶1、反應(yīng)時(shí)間為3 h的條件下，分別在25、35、40、45、55、70 ℃下進(jìn)行水解反應(yīng)，根據(jù)“1.2.2”，選擇水解溫度。在不同溫度下的水解結(jié)果如圖2。由圖2可知，40 ℃下對大豆異黃酮的水解最完全；而較低、較高溫度下的水解效果都較差。 70 ℃的水解效果最差，可能溫度過高，已致部分酶失活。所以，選擇水解溫度為40 ℃。

2.1.3 底物質(zhì)量濃度對大豆異黃酮水解的影響

在pH 5.0、酶底體積比為3∶1、溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間為3 h的條件下，分別對1、2、3、4、5 mg/mL的底物進(jìn)行水解反應(yīng)，根據(jù)“1.2.2”，選擇底物質(zhì)量濃度。不同質(zhì)量濃度底物的水解結(jié)果如圖3。由圖3可見，隨著底物質(zhì)量濃度增加，水解效果變差。其中，對1 mg/mL的大豆異黃酮的水解非常徹底，對2 mg/mL的大豆異黃酮的水解也較完全，鑒于較高濃度下苷元生成量較大，因此，選擇底物質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

0,底物；25～70,分別為25、35、40、45、55、70 ℃圖2 不同水解溫度的大豆異黃酮TLC圖譜Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the hydrolysis of isoflavone

0,底物；1～5,分別為1、2、3、4、5 mg/mL圖3 不同底物質(zhì)量濃度的大豆異黃酮TLC圖譜ig.3 Effect of substrate concentration on the hydrolysis of isoflavone

2.1.4 酶底體積比對大豆異黃酮水解的影響

在pH 5.0、溫度為40 ℃、底物質(zhì)量濃度為2 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間為3 h的條件下，分別以酶底體積比為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1水解大豆異黃酮，根據(jù)“1.2.2”選擇酶底體積比。不同酶底體積比的水解如圖4所示。由圖4可知，酶底體積比為1∶2時(shí)，水解效果最差，表明加酶量不足，對大豆異黃酮的水解不夠完全。但隨著加酶量比例的增加，水解效果的變化并不明顯，故選擇酶底體積比為1∶1即可。

2.2 糖苷酶水解大豆異黃酮最佳條件的確定

以水解溫度、水解時(shí)間、底物質(zhì)量濃度和酶底體積比為影響因素，分別選取3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。以大豆異黃酮水解率為指標(biāo)，確定最佳水解條件。正交試驗(yàn)因素水平L9(34)表如表2，結(jié)果分析如表3。

0,底物；1～5,酶底體積比分別為1∶1、2∶1、1∶2、3∶1、4∶1

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.2 The factors and levels of orthogonal experimen

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.3 The results and calculations of orthogonal experiment

根據(jù)表3極差分析可知，四因素中，影響最為顯著的是酶底體積比，其次是底物質(zhì)量濃度和水解時(shí)間，影響最小的是水解溫度。分析原因，可能是所選溫度均在保持酶活的范圍，未導(dǎo)致顯著影響。即各因素的主次順序?yàn)椋篋>C>B>A。結(jié)合實(shí)際情況，考慮到水解時(shí)間對水解效果的影響較小，選擇水解時(shí)間為3 h，則四因素最優(yōu)水平組合為A2B2C2D3，故最佳水解工藝條件為：水解溫度為40 ℃，水解時(shí)間為3 h，底物質(zhì)量濃度為2 mg/mL，酶底體積比為2∶1。在該條件下水解大豆異黃酮，水解率為84.65%。

2.3 HPLC檢測水解產(chǎn)物

分別取適量標(biāo)準(zhǔn)品、底物及最佳條件水解的大豆異黃酮，經(jīng)甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液供試。HPLC圖譜如圖5～7。分析圖譜可知，經(jīng)糖苷酶作用，底物中的糖苷較徹底地轉(zhuǎn)化為苷元，染料木素的含量顯著增加。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品染料木素的HPLC圖Fig.5 HPLC of genistein

圖6 反應(yīng)底物的HPLC圖Fig.6 HPLC of substrate

圖7 酶反應(yīng)后的HPLC圖Fig.7 HPLC for hydrolysis from glycosidase reacti

3 結(jié) 論

通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，得出納豆菌所產(chǎn)糖苷酶水解大豆異黃酮的最佳工藝條件為：水解溫度為40 ℃，水解時(shí)間為3 h，底物質(zhì)量濃度為2 mg/mL，酶底體積比為2∶1。此時(shí)，其水解率達(dá)84.65%。

經(jīng)HPLC檢測，在納豆菌糖苷酶的作用下，底物中80%以上的糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)換為苷元型異黃酮，且主要轉(zhuǎn)化為染料木素。

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