農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫色紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化

蔡琪敏,蔣冬花,嵇 豪,藍(lán)麗精

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫色紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化

蔡琪敏,蔣冬花3,嵇 豪,藍(lán)麗精

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

通過(guò)優(yōu)化各種轉(zhuǎn)化因素,建立了根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)紅曲霉 (M onascus)的高效轉(zhuǎn)化體系:紅曲霉在 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng) 21 d后收集孢子,制備紅曲霉孢子懸浮液,濃度為 106個(gè) /mL,根癌農(nóng)桿菌濃度為 OD600值 0.5,誘導(dǎo)劑AS濃度為 100μmol/L,農(nóng)桿菌與紅曲霉在 25℃共培養(yǎng) 3 d。采用此轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建了含有 530多個(gè)轉(zhuǎn)化子的紅曲霉 T2DNA插入突變體庫(kù)。隨機(jī)選取 50株轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行分子驗(yàn)證和穩(wěn)定性檢測(cè),證明 T2DNA成功插入紅曲霉基因組 DNA中,并能穩(wěn)定遺傳。最后,通過(guò)形態(tài)觀察篩選出 8株變異較大的菌株,為以后的紅曲霉基因功能研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

紅曲霉;根癌農(nóng)桿菌;T2DNA;突變體庫(kù)

紅曲霉又名紅曲、紅糟、紅大米,真菌界、真菌門(mén)、子囊菌亞門(mén)、不整子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科[1],是我國(guó)重要的微生物資源。紅曲霉在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能產(chǎn)生很多生理活性物質(zhì),如紅曲色素、Monacolin K、γ2氨基丁酸、麥角固醇、各種酶類(lèi)物質(zhì)等,國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)此關(guān)注較多[223]。近年來(lái),紅曲霉的研究除了集中在菌種選育及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化等方面外,分子生物學(xué)研究也逐漸起步,尤其是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo) T2DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的引入對(duì)紅曲霉相關(guān)功能基因的研究產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用。De2Groot等[4]利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了黑曲霉 (Aspergillus niger)、里氏木霉 (Trichodem a ree2 sei)、鏈孢霉 (N eurospora crassa)等 6種真菌,為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化開(kāi)創(chuàng)了先河。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的機(jī)理與植物相似:根癌農(nóng)桿菌將T2DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞主要依賴(lài) Ti質(zhì)粒上一系列V ir基因的表達(dá)。VirA基因編碼的蛋白A結(jié)合植物傷口釋放的單糖和酚類(lèi)物質(zhì)后自身激化,其保守的組氨酸殘基被磷酸化。磷酸化的蛋白A將其上的磷酸鹽轉(zhuǎn)化到 VirG蛋白的天冬氨酸殘基上,激活 VirG蛋白。激活的VirG結(jié)合到 V ir基因啟動(dòng)子的特定區(qū)域,打開(kāi)VirB、C、D、E、H等幾個(gè)基因的表達(dá)。其中 V irD1/VirD2共同切開(kāi) T2DNA的邊界區(qū)域,VirD2蛋白在切割后結(jié)合在 T2DNA的 5′端,其 C2端的 NLSs序列將 T2DNA導(dǎo)向植物細(xì)胞。VirC基因通過(guò)結(jié)合在 RB附近的非 T2DNA區(qū)域以增強(qiáng)V irD對(duì) RB的切割效率。單鏈結(jié)合蛋白 VirE結(jié)合到 T2DNA單鏈上形成 T2DNA復(fù)合體,在 Vir B的作用下此復(fù)合體通過(guò)農(nóng)桿菌細(xì)胞膜進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到植物的基因組[5]。目前,農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物上應(yīng)用較為廣泛,但在真菌中的應(yīng)用還不是很多,農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲霉轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究更是鮮有報(bào)道。對(duì)紅曲霉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和基因突變,從分子水平研究基因功能,探討作用機(jī)理是紅曲霉研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。本研究以微生物實(shí)驗(yàn)室保存的高產(chǎn)色素的紅曲霉菌種 S為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)對(duì)根癌農(nóng)桿菌濃度、紅曲霉培養(yǎng)時(shí)間、紅曲霉分生孢子液濃度、誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮 (AS)濃度、農(nóng)桿菌與紅曲霉的共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)膜類(lèi)型等轉(zhuǎn)化因素的優(yōu)化,建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲霉的高效轉(zhuǎn)化體系,構(gòu)建 T2DNA插入突變體庫(kù),獲得了 530株轉(zhuǎn)化子菌株。隨機(jī)選取 50株轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行了分子驗(yàn)證和穩(wěn)定性檢測(cè),證明 T2 DNA成功插入紅曲霉基因組 DNA中,并能穩(wěn)定遺傳。最后,篩選出 8株變異較大的菌株,以期為深入研究紅曲霉的基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 ①紫色紅曲霉 (M onascus purpu2 reus)S菌株:由實(shí)驗(yàn)室自主分離純化篩選得到,具有高產(chǎn)色素能力;②根癌農(nóng)桿菌菌株 AGL1:由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究院王政逸教授惠贈(zèng),此菌含有卡那霉素抗性基因和潮霉素基因,雙元載體為含高效啟動(dòng)子 trpC的 pAT2 MT1,由表達(dá)質(zhì)粒 pCAMB IA 1300改造而成,其中pCaMV35S2Hph被替換為 TrpC2Hph。

1.1.2 主要試劑 乙酰丁香酮 (AS)、22(N2嗎啉)乙磺酸鈉 (MES)、卡那霉素、頭孢霉素、鏈霉素、潮霉素 B均為分析純,購(gòu)于北京科百奧生物科技有限責(zé)任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDA)、LB培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基 ( IM)、共培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Co2 IM)。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化紅曲霉的基本步驟 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化方法主要參照 De2Gro2 ot[4]和 Covert等[6]的報(bào)道進(jìn)行,并做少許修改。

1.2.2 紫色紅曲霉 S菌株對(duì)潮霉素的敏感性檢測(cè)挑取 S菌株菌絲接種于含不同濃度潮霉素 B的PDA培養(yǎng)基 ,濃度分別為 0、100、150、200、250μg/mL,30℃培養(yǎng) 7 d后觀察記錄,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 各種因素對(duì)轉(zhuǎn)化率影響的研究 ①根癌農(nóng)桿菌濃度:在不同時(shí)間測(cè)定 IM培養(yǎng)基中農(nóng)桿菌的 OD600值 ,使其分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8,進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) ,研究農(nóng)桿菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響;②紅曲霉培養(yǎng)時(shí)間:將紅曲霉接種于PDA培養(yǎng)基 ,30 ℃分別培養(yǎng) 7、14、21、28 d,制備分生孢子液,研究紅曲霉培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響;③紅曲霉分生孢子液濃度:用無(wú)菌水將紅曲霉孢子分別稀釋至 104、105、106、107個(gè) /mL,進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),研究紅曲霉分生孢子液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響;④誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮 (AS)濃度:將 IM與 Co2 IM培養(yǎng)基中的 AS濃度分別增加至 60、80、100、120、140、160μmol/L,研究誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮 (AS)濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響;⑤共培養(yǎng)溫度:將農(nóng)桿菌與紅曲霉孢子混合液均勻涂于 Co2 IM培養(yǎng)基上的硝酸纖維素膜 (NC膜 )表面,于 20、25、30、35 ℃共培養(yǎng),研究共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響;⑥共培養(yǎng)時(shí)間:將農(nóng)桿菌與紅曲霉孢子分別共培養(yǎng) 2、3、4、5 d,研究共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響;⑦共培養(yǎng)膜類(lèi)型:分別將農(nóng)桿菌與紅曲霉孢子混合液共培養(yǎng)在硝酸纖維素膜 (NC膜)、定性濾紙、普通紙表面,研究膜類(lèi)型對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性分析 將 530株轉(zhuǎn)化子接種到 PDA培養(yǎng)基上,隨機(jī)挑選 50株突變株接種到不含潮霉素 B的 PDA培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng) 7 d。連續(xù)轉(zhuǎn)接 6次后,再轉(zhuǎn)接到含 200μg/mL潮霉素 B的 PDA培養(yǎng)基上,同時(shí)接種出發(fā)菌株 S作為對(duì)照,30℃培養(yǎng),觀察菌落生長(zhǎng)情況,計(jì)算其穩(wěn)定性。計(jì)算公式如下:轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性 (%)=(潮霉素 B抗性平板上菌落數(shù) /第 1次接種到PDA平板上的菌落數(shù))×100%。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子的 PCR鑒定 紅曲霉基因組 DNA采用 CTAB[7]法提取。根據(jù) pAT MT1上的潮霉素基因序列設(shè)計(jì)引物 HygS1和 HygA1,序列為:5′2 ATGCCTGAACTCACCGCGAC23′,5′2CTATTCCTTT GCCCTCGGAC23′,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系 (50 μL):模板 1μL,dNTP(10 mmol/L)1μL,Mg2+(25 mmol/L)3μL,10×Taq緩沖液 5μL,引物(10μmol/L)各 1μL,Taq酶 (5 U/μL)1μL,ddH2O 37μL。擴(kuò)增條件:94℃ 3 min,94℃ 20 s,58℃60 s,72℃2 min,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子的形態(tài)學(xué)觀察 將 530多株轉(zhuǎn)化子接種到 PDA培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng) 7 d,比較突變株與出發(fā)菌株在菌落形態(tài)、顏色等方面的差異。

2 結(jié) 果

2.1 紫色紅曲霉 S菌株對(duì)潮霉素的敏感性檢測(cè)

將 S菌株的菌絲接種于含不同濃度潮霉素B的 PDA培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng) 7 d。結(jié)果顯示,當(dāng)潮霉素 B濃度為 150μg/mL時(shí),紅曲霉菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制,而當(dāng)潮霉素 B濃度達(dá)到 200μg/mL時(shí),菌絲完全不能生長(zhǎng)。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇潮霉素 B的最佳篩選濃度為 200μg/mL。

2.2 各種因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

2.2.1 根癌農(nóng)桿菌濃度 從理論上講,農(nóng)桿菌濃度越高,接觸并附著到紅曲霉孢子的機(jī)會(huì)就越多,其轉(zhuǎn)化效率也就越高。如圖1所示,隨著農(nóng)桿菌濃度的升高,轉(zhuǎn)化子數(shù)目相應(yīng)增加。但有研究表明,農(nóng)桿菌濃度越高,后續(xù)操作中農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)不易控制,而且轉(zhuǎn)化子中 T2DNA的拷貝數(shù)越高[8]。為了降低轉(zhuǎn)化子中 T2DNA的拷貝數(shù),使后續(xù)實(shí)驗(yàn)更易控制,選擇了 OD600值 0.5為農(nóng)桿菌的最適濃度。

2.2.2 紅曲霉培養(yǎng)時(shí)間 紅曲霉培養(yǎng)得越久,其孢子成熟度也越高,真菌孢子成熟度對(duì)轉(zhuǎn)化有很大的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2,紅曲霉在 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)到 21天時(shí),轉(zhuǎn)化子數(shù)目最多,達(dá)到 28個(gè) /平皿,而 28天時(shí)只有 23個(gè) /平皿,其原因可能是紅曲霉孢子過(guò)于老化,活力不夠。

圖1 根癌農(nóng)桿菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of concentration ofAgrobacterium

圖2 紅曲霉培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of culture time ofM onascus purpureus

2.2.3 紅曲霉分生孢子液濃度 由圖3可知,不同濃度的紅曲霉孢子對(duì)轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。當(dāng)孢子液濃度為 106個(gè) /mL時(shí),轉(zhuǎn)化子數(shù)目達(dá)到 25個(gè) /平皿,因此,選擇紅曲霉孢子液的最佳濃度為106個(gè) /mL。

2.2.4 誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮 (AS)濃度 與農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化相似,只有在農(nóng)桿菌與受體細(xì)胞的共培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)劑 AS時(shí),轉(zhuǎn)化才能發(fā)生[5]。圖4結(jié)果表明,誘導(dǎo)劑 AS濃度越高,轉(zhuǎn)化子數(shù)目越多,尤其是 100μmol/L和 120μmol/L時(shí),轉(zhuǎn)化子數(shù)目都達(dá)到了 26個(gè) /平皿。但是 AS價(jià)格較高,考慮到經(jīng)濟(jì)問(wèn)題,選擇了 AS最佳濃度為 100μmol/L。

2.2.5 共培養(yǎng)溫度 選擇 4個(gè)共培養(yǎng)溫度進(jìn)行研究,結(jié)果如圖5所示。當(dāng)共培養(yǎng)溫度為 25℃時(shí),每個(gè)平皿上能得到 24個(gè)轉(zhuǎn)化子,而 30℃時(shí),轉(zhuǎn)化子數(shù)目略有下降。分析原因可能是,對(duì)本實(shí)驗(yàn)所用的紅曲霉和農(nóng)桿菌菌株而言,兩者都適合的溫度為 25℃,此時(shí)最有利于轉(zhuǎn)化。

圖3 紅曲霉孢子液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of concentration ofMonascusspores 1、2、3、4分別代表104、105、106、107個(gè) /mL 1、2、3、4 respectivelymeans 104、105、106、107spores/mL

圖4 誘導(dǎo)劑 AS濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of concentration of inducerAS

2.2.6 共培養(yǎng)時(shí)間 圖6結(jié)果表明,共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng),得到的轉(zhuǎn)化子越多。但在共培養(yǎng)的第 3天,紅曲霉菌絲頂端開(kāi)始有分生孢子長(zhǎng)出,到第 4天、第 5天分生孢子明顯增多。在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的操作中,孢子易被培養(yǎng)基沖散,如果延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為 3 d。

2.2.7 共培養(yǎng)膜類(lèi)型 實(shí)驗(yàn)時(shí),分別將農(nóng)桿菌與紅曲霉孢子混合液共培養(yǎng)在硝酸纖維素膜 (NC膜)、定性濾紙、普通紙表面,研究膜的類(lèi)型對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明,膜類(lèi)型對(duì)轉(zhuǎn)化的影響較大,在普通紙表面,轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)不出來(lái),而定性濾紙較薄,孔隙較大,共培養(yǎng)后不容易轉(zhuǎn)膜。只有在硝酸纖維素膜(NC膜)上,轉(zhuǎn)化子能順利長(zhǎng)出,而且也不影響轉(zhuǎn)膜,具體原因可能與孔徑大小、膜厚度等因素有關(guān)。

圖5 共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of co2culture temperature

圖6 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of co2culture time

2.3 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性分析

將 530多株轉(zhuǎn)化子接種到 PDA培養(yǎng)基上,隨機(jī)挑選 50株突變株進(jìn)行穩(wěn)定性研究。結(jié)果顯示,除 1株外,其余 49株均能在含有 200μg/mL潮霉素B的 PDA培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),其遺傳穩(wěn)定性高達(dá) 98%,表明潮霉素抗性基因已經(jīng)整合到紅曲霉基因組中,并能穩(wěn)定遺傳。

2.4 轉(zhuǎn)化子的 PCR鑒定

如果根癌農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒中的 T2DNA成功轉(zhuǎn)移到紅曲霉基因組 DNA中,就可以在 900 bp附近擴(kuò)增出潮霉素基因特征條帶,據(jù)此可以鑒定 T2 DNA是否成功插入到紅曲霉基因組中。隨機(jī)挑選 8株轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行 PCR鑒定,并與出發(fā)菌株S比較,結(jié)果如圖7所示。8株供試菌株在 900 bp左右均有條帶,且條帶清晰,無(wú)雜帶,說(shuō)明 T2DNA已經(jīng)插入到紅曲霉基因組DNA中。

2.5 轉(zhuǎn)化子的形態(tài)學(xué)觀察

將 530多株轉(zhuǎn)化子接種到 PDA培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng) 7 d,比較突變株與出發(fā)菌株在菌落形態(tài)、顏色等方面的差異。結(jié)果表明,大部分突變株與出發(fā)菌株差別不大,只有少數(shù)突變株發(fā)生較大變化。選取有代表性的 8株轉(zhuǎn)化子菌株與出發(fā)菌株S一起觀察,其菌落特征見(jiàn)表1,菌落形態(tài)見(jiàn)圖8。

圖7 轉(zhuǎn)化子總基因組中 hph基因的 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR analysis ofhphgene in hygromycin B2resistant transformants of S

表1 野生型菌株與部分轉(zhuǎn)化子的形態(tài)特征Table 1 Characteristics ofwild2type strain S and partial transformants

圖8 部分轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)(30℃,PDA,7 d)Fig.8 Colonymorphology of partial transfor mants(30℃,PDA,7 d)

3 討 論

與其他轉(zhuǎn)化方法相比,農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)具有轉(zhuǎn)化效率高[4]、材料多樣、來(lái)源簡(jiǎn)單[9]、操作簡(jiǎn)單[10]、單拷貝 T2DNA隨機(jī)插入、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn),是一種很有前途的真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法。本實(shí)驗(yàn)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù),通過(guò)對(duì)紅曲霉孢子懸浮液濃度等因素的探討,得到了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲霉的高效轉(zhuǎn)化體系:紅曲霉在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 21 d后收集孢子,制備紅曲霉孢子液,濃度為 106個(gè) /mL,根癌農(nóng)桿菌濃度 OD600為 0.5,誘導(dǎo)劑 AS濃度為 100μmol/L,農(nóng)桿菌與紅曲霉在 25℃共培養(yǎng) 3 d。采用此轉(zhuǎn)化體系成功獲得了 530個(gè)具有潮霉素抗性的紅曲霉轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)選取 50株轉(zhuǎn)化子菌株進(jìn)行了分子驗(yàn)證和穩(wěn)定性檢測(cè),證明 T2DNA成功插入紅曲霉基因組DNA中,并能穩(wěn)定遺傳。最后,通過(guò)形態(tài)觀察等方法初步篩選出了 8株變異較大的轉(zhuǎn)化子,用于后續(xù)研究。

在研究中發(fā)現(xiàn),真菌原材料、根癌農(nóng)桿菌和真菌種類(lèi)、共培養(yǎng)的篩選環(huán)境等多種因素會(huì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的效率。不同根癌農(nóng)桿菌菌株、不同的雙元載體、不同真菌都會(huì)影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化。方衛(wèi)國(guó)等[5]曾以含有pB I121為基本骨架、潮霉素為選擇標(biāo)記的雙元表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株 LBA4404轉(zhuǎn)化黑曲霉,但未獲得轉(zhuǎn)化子,曾用另外 1株紅曲霉菌株作為原材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化,效果很不理想。

誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮 (AS)是農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。在共培養(yǎng)過(guò)程中,沒(méi)有 AS誘導(dǎo)就不能獲得轉(zhuǎn)化子,隨著 AS濃度的增加,轉(zhuǎn)化效率也相應(yīng)提高[11212]。對(duì)于農(nóng)桿菌在預(yù)培養(yǎng)時(shí)是否需要 AS的誘導(dǎo),不同的研究者有不同的看法[13214]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,在預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)過(guò)程中加入 AS均能提高轉(zhuǎn)化效率,但濃度過(guò)高不僅浪費(fèi)藥品,轉(zhuǎn)化效率也提高不大。

共培養(yǎng)溫度和時(shí)間也是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。Campoy等[15]的研究表明,當(dāng)共培養(yǎng)溫度和受體最適生長(zhǎng)溫度一致時(shí),能得到最多的轉(zhuǎn)化子。本實(shí)驗(yàn)中,采用 25℃共培養(yǎng)能得到最多的轉(zhuǎn)化子,可能因?yàn)樵诖藯l件下農(nóng)桿菌最適合生長(zhǎng),從而有利于農(nóng)桿菌的侵染,還可以降低菌絲的生長(zhǎng)速度,以便 T2DNA區(qū)的整合。共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響農(nóng)桿菌的吸附和 T2DNA轉(zhuǎn)移,本實(shí)驗(yàn)中共培養(yǎng) 3 d比較適合,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性克隆的產(chǎn)生。

紅曲霉等真菌的代謝過(guò)程較為復(fù)雜,要確切地闡明不同代謝途徑基因的功能及其相互關(guān)系需要大量的基因組信息。本實(shí)驗(yàn)研究的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化方法能夠高效快速地獲得轉(zhuǎn)化子,使紅曲霉在遺傳功能方面得到不同的改造,從而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

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Establishment and Optim ization ofAgrobacterium2mediated Transformation System s forM onascus purpureus

CA IQi2min,J IANGDong2hua,J IHao,LAN Li2jing
(Coll.of Chem.and Life Sci.,Zhejiang No rmal Uni.,Jinhua321004)

A high2effectiveAgrobacterium tum efaciens(A t)2mediatedM onascustransformation system was established through optimizing various transferring factors in this study.Spores ofM onascuscultured on PDA were collected 21 d after cultivation and prepared forM onascusspore suspension at 106/mL,and concentration of At wasOD600value at 0.5 with inducing agent concentration at100μmol/L.ThenA tandM onascuswere cultured together for 3 d in 25℃.Adopted this transformation system an insertmutant library containing over 530 transfor mants ofM onascusT2DNA was established.50 transformant strainswere randomly selected to carry out theirmolecular verification and stability,the results showed that T2DNA had successfully inserted to genome DNA ofM onascus purpureusand could be steadily in2 herited.Finally,eight strains of large variation were selected through morphological observation thus establish a cer2 tain foundation for further study onM onascusgene function.

M onascus;Agrobacterium tumefaciens;T2DNA;mutant library

Q933

A

1005-7021(2010)05-0068-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(31070008);浙江省自然科學(xué)基金(Y3090343)

蔡琪敏 女,碩士。研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。

3通訊作者。Tel:0579282283832,E2mail:jdh@zjnu.cn

2010208218;

2010209212