滸苔脂肪酸前處理方法優(yōu)化及GC/MS分析

尹琳琳, 楊佰娟, 鄭 立, 韓笑天, 王能飛, 王小如, 楊東方

（1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 200090; 2. 國家海洋局第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心, 山東青島 266061; 3. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071）

滸苔脂肪酸前處理方法優(yōu)化及GC/MS分析

尹琳琳1,2, 楊佰娟2, 鄭 立2, 韓笑天3, 王能飛2, 王小如2, 楊東方1

（1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 200090; 2. 國家海洋局第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心, 山東青島 266061; 3. 中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071）

針對綠潮藻的快速化學(xué)溯源及資源化利用, 以滸苔為對象, 對其脂肪酸測定過程進行了研究;同時, 通過對滸苔脂肪酸的皂化和甲酯化試劑、水浴溫度和水浴時間等反應(yīng)條件的優(yōu)化, 建立了綠潮藻脂肪酸前處理新方法。該方法的精密度在 0.38%～3.25%之間, 重現(xiàn)性在 0.65%～5.80%之間; 采用該方法測定福建、江蘇和青島的滸苔脂肪酸含量分別為0.10～5.69 mg/g、0.16～8.59 mg/g、0.10～4.76 mg/g。此方法可適用于滸苔等綠潮藻脂肪酸的實際測定。

綠潮; 脂肪酸; 皂化; 甲酯化

海洋藻類富含人體必需氨基酸、多聚不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)元素, 一直以來被作為人類的食物和營養(yǎng)來源[1～3]。隨著人們對健康和營養(yǎng)水平需求的提高, 從海藻中攝取多不飽和脂肪酸已日益受到關(guān)注[4,5]。因此掌握和優(yōu)化脂肪酸分離提取方法很有必要。目前, 藻類脂肪酸的研究多集中于脂肪酸的組成[6～10]、分類[11,12]和色譜分析條件比較[13], 有關(guān)脂肪酸前處理過程的研究甚少[14]。脂肪酸前處理方法不統(tǒng)一, 使得測定結(jié)果無可比性, 準確性更無從得知。

文獻報道脂肪酸前處理的皂化過程中使用的皂化溶劑主要有氫氧化鈉甲醇溶液（NaOH-CH3OH）[15,16]和氫氧化鉀甲醇溶液（KOH-CH3OH）[17]; 皂化時間長短不同, 在10 min到2 h之間[9,10,15,16]; 皂化過程中的水浴溫度也不盡相同（55～75 ℃）[10,15～18]。同樣脂肪酸甲酯化過程也不統(tǒng)一, 常用的甲酯化溶劑是鹽酸甲醇溶液（HCl-CH3OH）[10,15～17]和三氟化硼甲醇溶液（BF3-CH3OH）[19,20]; 甲酯化時間最短只需 10 min[18],最長的時間可達1 h[16,17]; 甲酯化水浴溫度差異很大,在 60～75 ℃之間[9,10,15～18]。

針對藻類脂肪酸前處理沒有統(tǒng)一方法的情況,在前人研究基礎(chǔ)上, 以滸苔為研究對象, 比較滸苔脂肪酸前處理過程中試劑、時間、溫度等影響因素,得出最佳的脂肪酸前處理方法, 并考察該方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

試驗所用的新鮮滸苔, 經(jīng)鑒定為滸苔屬滸苔（Enteromorpha prolifera）, 2009年上半年采自福建、江蘇和青島海域。樣品用干凈海水洗去表面雜質(zhì)和附著物, 于60 ℃烘箱中烘干, ?20 ℃冰箱中封口備用。

1.2 儀器、試劑

7890N GC/5975N MS型氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）; 電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

無水硫酸鈉: 600 ℃烘燒 4 h, 冷卻后置于干燥器中; 氯仿、甲醇、正己烷均為色譜純; 氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸、硼酸乙醚為分析純;

脂肪酸標(biāo)樣: 37種脂肪酸混合標(biāo)準品和19碳酸（上海泉島公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪酸前處理方法

實驗分為皂化條件優(yōu)化和甲酯化條件優(yōu)化兩部分。皂化條件優(yōu)化中包括試劑、水浴時間和溫度 3個因素。皂化試劑選用文獻中常見的 NaOH-CH3OH溶液、KOH-CH3OH溶液; 水浴時間選用15、30、60和120 min; 水浴溫度選取60、65、70、75 ℃。甲酯化優(yōu)化中同樣包括試劑、水浴時間和溫度3個因素。酯 化試 劑 選用 兩 種, 即 HCl?CH3OH 溶液 和BF3-CH3OH 溶液; 酯化時間選用 10、20、30、60 min。酯化過程選取與皂化過程相同的溫度梯度。

取適量脂肪酸樣品置于 20 mL試管中, 加入 5 mL皂化試劑, 一定水浴溫度下反應(yīng)一段時間, 冷卻至室溫, 再加入 4 mL甲酯化試劑, 混勻, 水浴一定時間。加1 mL正己烷溶液, 靜置分層, 取上清液作GC/MS分析試樣。每個優(yōu)化實驗進行三次平行實驗,取平均值進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

1.3.2 脂肪酸色譜條件

GC 條件: 毛細管色譜柱 HP-5MS（30 m×250μm×0.25 μm）; 進樣口溫度 260 ℃; 升溫程序, 起始溫度為50 ℃, 保持1 min, 以20℃/min升至190 ℃,再以 4 ℃/min升至 240 ℃, 然后以 10℃/min升至280 ℃, 維持2 min。載氣為高純度氦氣; 不分流; 進樣量 1 μL。

MS條件: EI離子源, 電子能量70 eV; 離子源溫度 230 ℃; 四極桿溫度 150℃; 傳輸線溫度 300 ℃;溶劑延時3 min; 掃描范圍35～400 amu; 掃描方式為全掃描（Scan）方式。

1.4 標(biāo)準曲線的繪制

內(nèi)標(biāo)溶液: 準確稱取15.00 mg19碳酸于10 mL容量瓶中, 用正己烷稀釋至刻度。

標(biāo)準溶液: 將混合標(biāo)準溶液用正己烷稀釋至100倍。

1.5 樣品的測定和計算

標(biāo)準溶液的測定: 取標(biāo)準溶液1 μL注入氣相色譜儀, 得到標(biāo)準溶液的譜圖, 經(jīng)計算得到各脂肪酸的校正因子。

樣品的測定: 取1 μL待測樣品注入氣相色譜儀進行測定, 根據(jù)標(biāo)準溶液的譜圖進行定性, 根據(jù)校正因子進行定量。

游離脂肪酸含量的計算: 根據(jù)被測物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量及在色譜圖上相應(yīng)的峰面積比, 由校正因子按下式求游離脂肪酸的含量:

其中, Xi為樣品脂肪酸i的含量; Ws為樣品中加入內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量; As為內(nèi)標(biāo)物的峰面積; Ai為脂肪酸i的峰面積; W 為樣品藻粉質(zhì)量; Fsi為相對校正因子,計算公式如下:

其中, Wi’為標(biāo)準品脂肪酸i的質(zhì)量; As’為標(biāo)準品中內(nèi)標(biāo)物的峰面積; Ws’為標(biāo)準品中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量;Ai’為標(biāo)準品中脂肪酸i的峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 滸苔脂肪酸前處理優(yōu)化

2.1.1 皂化試劑對滸苔脂肪酸濃度的影響

皂化試劑是滸苔脂肪酸前處理過程中影響因素之一。本實驗在前人文獻基礎(chǔ)上, 選用 NaOHCH3OH溶液、KOH-CH3OH溶液作為皂化試劑。實驗結(jié)果表明, 兩種皂化試劑制備的脂肪酸濃度相差不大, 說明皂化試劑對脂肪酸濃度影響較小。結(jié)合文獻與實際, 選用KOH-CH3OH溶液作為皂化試劑。

2.1.2 皂化時間對滸苔脂肪酸濃度的影響

在皂化試劑KOH-CH3OH溶液5 mL、皂化溫度60 ℃、甲酯化試劑HCl-CH3OH溶液4 mL、甲酯化時間20 min、甲酯化溫度60 ℃的條件下考察水浴時間對滸苔脂肪酸濃度的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同皂化時間的脂肪酸濃度Fig. 1 The concentrations of fatty acids at different saponification times

從圖 1中可以看出, 大多數(shù)脂肪酸含量隨皂化時間的增加出現(xiàn)先增后降的趨勢, 皂化時間小于60 min時, 脂肪酸濃度隨時間的增加而增加, 當(dāng)皂化時間超過 60 min, 脂肪酸的含量隨時間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢。說明皂化時間對皂化效率有重要影響, 時間短可能導(dǎo)致樣品皂化不完全, 過長一方面造成時間的浪費, 另一方面, 皂化時間過長可能會引起脂肪酸的損失。故選用60 min作為皂化時間。

2.1.3 皂化溫度對滸苔脂肪酸濃度的影響

保持皂化試劑KOH-CH3OH溶液5 mL、皂化時間60 min、甲酯化試劑HCl-CH3OH溶液4 mL、甲酯化時間20 min、甲酯化溫度60 ℃的條件不變, 考察水浴溫度對滸苔脂肪酸濃度的影響作用, 結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同皂化溫度的脂肪酸濃度Fig. 2 The concentrations of fatty acids at different saponification temperatures

由圖2可知, 除C18:3外, 絕大多數(shù)脂肪酸的含量在水浴溫度為60 ℃時最高, 其次是70 ℃和65 ℃,75 ℃時脂肪酸的含量最低。此外, 從不同反應(yīng)條件的實驗反應(yīng)過程上看, 水浴溫度過高會引起溶劑不同程度的蒸發(fā), 可能導(dǎo)致有效成分的損失。綜合以上因素, 水浴溫度采用 60 ℃為宜。

2.1.4 甲酯化試劑對滸苔脂肪酸濃度的影響

脂肪酸甲酯化溶劑大多為酸性甲醇溶液, 根據(jù)文獻報道, 本實驗選取最常用的HCl-CH3OH溶液和BF3-CH3OH溶液, 比較它們對脂肪酸濃度的影響,實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同甲酯化試劑的脂肪酸濃度Fig. 3 The concentrations of fatty acids by different methyl esterification reagents

從圖3中可以看出, 除C18:0外, HCl-CH3OH溶液甲酯化所得脂肪酸濃度顯著高于經(jīng)BF3-CH3OH溶液甲酯化所得脂肪酸的濃度。且BF3-CH3OH溶液作為甲酯化試劑的重現(xiàn)性較差。原因主要是, 其一, 工業(yè)用BF3-CH3OH溶液成品的沸點為59 ℃, 實驗水浴溫度大于其沸點, 溫度過高, 可能影響甲酯化試劑的作用, 從而影響滸苔脂肪酸濃度。其二, BF3溶劑對光非常敏感需要避光保存, 在實驗過程中很難滿足這個條件。綜合以上因素, 確定HCl-CH3OH溶液為甲酯化試劑。

2.1.5 甲酯化時間對滸苔脂肪酸濃度的影響

在皂化試劑KOH-CH3OH溶液5 mL、皂化溫度60 ℃、皂化時間 60 min、甲酯化試劑 HCl-CH3OH溶液 4 mL、甲酯化溫度 60 ℃的條件下, 考察甲酯化時間對產(chǎn)物中脂肪酸濃度的影響, 結(jié)果見圖4。

圖4 不同甲酯化時間的滸苔脂肪酸濃度Fig. 4 The concentrations of fatty acids at different methyl esterification times

由圖 4可知, 甲酯化時間從 10 min增加到 20 min時, 滸苔脂肪酸的濃度逐漸增大, 甲酯化時間為20 min時, 產(chǎn)物的濃度達到最大值。隨后增加甲酯化時間, 脂肪酸濃度不增加反而減少。這說明甲酯化時間過短, 甲酯化過程不完全, 時間太長可能引起脂肪酸的損失, 因此, 較短的甲酯化時間更有利于甲酯化反應(yīng)的進行。故選擇20 min作為甲酯化時間。

2.1.6 甲酯化溫度對滸苔脂肪酸濃度的影響

保持皂化試劑KOH-CH3OH溶液5 mL、皂化溫度60 ℃、皂化時間60 min、甲酯化試劑HCl-CH3OH溶液4 mL、甲酯化時間20 min的條件不變, 考察了溫度對滸苔脂肪酸甲酯化過程的作用影響, 結(jié)果見圖 5。

圖5 不同甲酯化溫度的脂肪酸濃度Fig. 5 The concentrations of fatty acids at different methyl esterification temperatures

由圖5可知, 隨著甲酯化溫度的增加, 大部分脂肪酸濃度成降低趨勢。隨著甲酯化水浴溫度增加, 甲酯化試劑有不同程度的損失, 溫度越高損失越大,這說明, 溫度的增加不利于脂肪酸甲酯化過程。因此,甲酯化溫度為60 ℃最佳。

2.2 脂肪酸前處理方法精密度、重現(xiàn)性

2.2.1 精密度實驗

取滸苔樣品1份, 在優(yōu)化條件下制備供試液, 采用1.3.2所述色譜條件, 連續(xù)進樣5次, 結(jié)果9種脂肪酸相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準偏差（RSD）分別在 0～0.19%和 0.38%～3.25%的范圍內(nèi),說明該方法精密度良好。

2.2.2 重現(xiàn)性實驗

取同一批號滸苔樣品 5份, 按優(yōu)化條件下制備供試液, 分別測定脂肪酸。結(jié)果9種脂肪酸相對保留時間和相對峰面積相對標(biāo)準偏差（RSD）分別為 0～0.31%和 0.65%～5.8%。表明該方法的重現(xiàn)性良好,符合測定的要求。

2.3 滸苔脂肪酸GC/MS分析

根據(jù)上述脂肪酸前處理方法, 對福建霞浦、江蘇和青島 3個海區(qū)的滸苔檢測, 得出滸苔脂肪酸的總離子色譜圖, 經(jīng)質(zhì)譜分析后, 由NIST5.0標(biāo)準圖譜庫進行檢索, 確定脂肪酸中的各個組分, 并用內(nèi)標(biāo)進行定量, 結(jié)果見表1。

由表1可知, 福建、江蘇、青島的滸苔脂肪酸種類相同, 均檢出9種脂肪酸。福建霞浦滸苔樣品脂肪酸各組分的含量在0.10～5.69 mg/g之間, 江蘇滸苔脂肪酸范圍是 0.16～8.59 mg/g, 青島為 0.10～4.76 mg/g。其中, C16:0、C18:1、C18:2、C18:3四種脂肪酸在3個海區(qū)滸苔中的含量均最高, 可以看出滸苔脂肪酸以C16和C18為主。此外, 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)滸苔樣品含有多種多不飽和脂肪酸（PUFA）, 據(jù)現(xiàn)有文獻報道[21], PUFA對抗腫瘤、免疫活性調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要的作用。

表1 滸苔脂肪酸組成及其含量（mg/g）Tab. 1 Compositions and contents of fatty acids in enteromorpha prolifera （mg/g）

3 結(jié)論

以脂肪酸的濃度作為評價指標(biāo), 采用單因素分析優(yōu)化滸苔脂肪酸的前處理方法, 結(jié)合實際, 確定滸苔脂肪酸前處理的最佳條件為, 以 KOH-CH3OH溶液為皂化試劑, 60 ℃水浴環(huán)境下皂化60 min; 以HCl-CH3OH溶液為甲酯化試劑, 60 ℃水浴甲酯化20 min。

通過對福建, 江蘇及青島滸苔的實際樣品分析,發(fā)現(xiàn)3種不同海域的滸苔組分相同, 均檢出9種脂肪酸, 且各種脂肪酸的含量較為相似。此外, 3個海區(qū)滸苔脂肪酸均含有多種 PUFA, 參考其重要作用, 可進行進一步實驗研究。

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Received: Dec, 10, 2009

Key words:green tide; fatty acids; saponification; methyl esterification

Abstract:For quick chemical traceability and resource utilization, a new pre-treatment method was developed for determination of fatty acids of enteromorpha prolifera. Operational parameters including reagents, time, and temperature for the saponification and methyl esterification which are expected to impact on the recoveries of analytes were optimized. The result indicated high precision （0.38%～3.25%） and the low relative deviation （0.65%～5.8%） of this new method. Moreover, by this method, fatty acids contents of enteromorpha prolifera at Fujian, Jiangsu, and Qingdao were determined to be 0.10～5.69, 0.16～8.59, and 0.10～4.76 mg/g, respectively. This method is appropriate for routine operations.

（本文編輯: 康亦兼）

Optimization and analyzation of fatty acids pre-treatment of enteromorpha prolifera by GC/MS

YIN Lin-lin1,2, YANG Bai-juan2, ZHENG Li2, HAN Xiao-tian3, WANG Neng-fei2,WANG Xiao-ru2, YANG Dong-fang1
（1. College of Aqua-life Science and Technology, Shanghai Fisheries University, Shanghai 200090, China; 2.Research Center for Marine Ecology, The First Institute of Oceanography, SOA, QingDao 266061, China;3.Institute of Oceanology, Chinese Academy of Science, Key Lab of Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao 266071, China）

P731.21

A

1000-3096（2010）11-0046-05

2009-12-10;

2010-04-20

海洋公益性行業(yè)科研專項項目（200805039）; 國家自然科學(xué)基金項目（20602009, 40776098）; 青島市科技計劃項目（08-1-3-10-JCH）;國家海洋局第一海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（2008G47,2008T32）.

尹琳琳（1985-）, 女, 山東濟南人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物化學(xué)研究, 電話: 0532-88966705, E-mail: linyinyl@126.com; 鄭立, 通信作者, 電話: 0532-88961802; E-mail:zhengli@fio.org.cn