鹽酸法舒地爾抑制小鼠EAE作用及機制研究

段惠潔，郭敏芳，尉杰忠，梁麗云，馬存根*

(1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內科，山西太原 030001；2.山西大同大學腦科學研究所，山西大同 037009)

鹽酸法舒地爾抑制小鼠EAE作用及機制研究

段惠潔1，2，郭敏芳2，尉杰忠2，梁麗云2，馬存根1，2*

(1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內科，山西太原 030001；2.山西大同大學腦科學研究所，山西大同 037009)

目的探討鹽酸法舒地爾（Fasudil hydrochloride）對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的抑制作用和可能的機制.方法按平均體重將C57BL／6雌性小鼠分為EAE組、鹽酸法舒地爾治療組和佐劑組，用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35－55多肽（MOG35－55）誘導EAE模型，佐劑組以等量生理鹽水代替.治療組于免疫后6 d開始按50 mg／（kg·d）腹腔注射鹽酸法舒地爾，EAE組和佐劑組用等量的生理鹽水作為對照.比較各組小鼠的各種表現(xiàn)，并進行癥狀評分.免疫后18～20 d取各組小鼠，制備脾臟淋巴細胞懸液，用MTT法檢測淋巴細胞的增殖情況，用ELISA法檢測并比較各組淋巴細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子INF－γ、IL－17、IL－10的水平.結果鹽酸法舒地爾能夠顯著改善EAE的癥狀，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）炎性浸潤及髓鞘脫失等病理變化，并且可抑制脾臟淋巴細胞分泌INF－γ、IL－17（P＜0.05），促進IL－10的分泌（P＜0.05）.結論鹽酸法舒地爾可以有效抑制小鼠EAE，這種抑制可能與其對脾淋巴細胞中INF－γ、IL－17表達的下調和IL－10表達的上調作用有關.

鹽酸法舒地爾 實驗性自身免疫性腦脊髓炎 INF－γ IL－17 IL－10

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種常見的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）炎性脫髓鞘病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊?MS的病因和發(fā)病機制很復雜，與遺傳、免疫、病毒感染等均有關聯(lián)，但其確切機制尚未完全清晰.探討MS的免疫學機制一直是人們關注的焦點.MS具有免疫學基礎的更多證據(jù)來自于動物模型——實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究.EAE是由特異性致敏的CD4＋T細胞介導的發(fā)生于敏感實驗動物的自身免疫性疾病，而細胞因子的生成和調節(jié)是CD4＋T細胞發(fā)揮效應作用的主要機制.CD4＋T細胞通常按照其分泌的細胞因子的不同，分為Th1和Th2兩種亞型.Th1型細胞產(chǎn)生IFN－γ等細胞因子，介導與炎癥有關的免疫應答，具有促炎性作用；Th2細胞分泌IL－10等細胞因子，對EAE和MS的病情有抑制作用[1]；IFN－γ可誘導Th1分化，抑制Th2細胞增殖[2].總之，在EAE和MS的病情演化中，由細胞因子構成的免疫調節(jié)網(wǎng)絡對其發(fā)生、發(fā)展以及緩解起著復雜的調節(jié)作用[3].

研究表明Rho激酶－II（ROCK－Ⅱ）特異抑制劑——鹽酸法舒地爾（Fasudil hydrochloride）通過減少外周淋巴細胞活化和遷移進入CNS，消除CNS的炎癥反應；促進神經(jīng)元胞體以及神經(jīng)軸突的再生等作用，可以緩解和改善EAE和MS的癥狀[4].本實驗應用Fasudil hydrochloride干預MOG35－55誘導的小鼠EAE，檢測脾臟淋巴細胞的增殖以及分泌細胞因子的情況，探討Fasudil hydrochloride有效改善EAE的可能機制.

1 材料與方法

1.1 材料

健康清潔級C57BL／6雌性小鼠60只，年齡6～8周，體質量 18～22 g，購自北京維通利華公司；MOG35－55由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成，純度HPLC 97%；百日咳毒素（PTX）購自北京畢特博生物技術有限公司；完全弗氏佐劑（CFA）購自Sigma公司；鹽酸法舒地爾注射液為天津紅日藥業(yè)股份有限公司饋贈.

1.2 方法

1.2.1 動物分組及EAE模型制備

清潔級C57BL／6雌性小鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周后，按平均體質量分為3組，即EAE組（20只），法舒地爾治療組（20只）和佐劑組（20只）.用生理鹽水將MOG33－35稀釋成終濃度為3 mg／mL，用完全弗氏佐劑（CFA）將結核桿菌（TB）稀釋成終濃度為3.5 mg／mL，然后將二者等體積混合，用注射器打成油包水狀，制成誘導EAE的抗原乳劑，按每只0.1 mL劑量，對EAE組和治療組小鼠給予免疫.方法是于小鼠背部后區(qū)中線兩側選取4個進針點皮下注射，佐劑組以生理鹽水代替MOG33－35稀釋液制成乳劑同法注射.記免疫后（p.i.）當日為d0p.i.，各組小鼠于d0p.i和d2p.i.分別給予腹腔注射百日咳毒素（PTX）700 ng／只，作為免疫增強劑.治療組于d6p.i.開始給予腹腔注射Fasudil hydrochloride 50 mg／（kg·d），每日一次，連續(xù)治療14 d，EAE組和佐劑組給予同等劑量生理鹽水.

1.2.2 臨床癥狀評分和體重變化

小鼠經(jīng)MOG免疫后，隔日采用盲法由兩名觀察者稱量并記錄每只小鼠的體重，采用國際通用的5分評分制對小鼠進行臨床評分，直至MOG免疫后40 d.評分標準：0分，無任何臨床癥狀；1分，尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙；2分，一側后下肢無力，被動翻身后可以恢復；3分，雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復，但給予刺激后可以挪動；4分，雙側后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡.癥狀介于兩者標準之間者以±0.5計.

1.2.3 取材

于d18～20p.i.用3%戊巴比妥麻醉動物，無菌取出脾臟后，生理鹽水心臟灌流，4%多聚甲醛灌流固定，解剖分離腦和脊髓，石蠟包埋做病理切片，行HE染色和Luxol Fast Blue髓鞘染色.

1.2.4 脾淋巴細胞的分離與制備

于d18～20 p.i.各組取8只小鼠，麻醉后75%酒精皮膚消毒，無菌取出脾臟，剪碎，用注射器針芯研磨，400目尼龍濾網(wǎng)過濾，置于 15 mL離心管，加入已消毒預冷的PBS中，1 200 r／min離心5 min，棄上清，再加入PBS，反復吹打重懸后再次離心，PBS洗3次，棄上清，按2 mL／管加入已消毒預冷的雙蒸水，低滲裂解紅細胞，45 s后按 1 mL／管快速加入已消毒預冷的2.7 mg／100 mL的NaCl，使還原為等滲，用已消毒預冷的 PBS補充體積至10 mL左右，1 200 r／min離心5 min，棄上清，重懸，細胞計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)液（高糖DMEM，5%的胎牛血清，100 U／mL青霉素－鏈霉素）將各管細胞密度調整至 1×109／L，接種在 96孔板中，200 μL／孔細胞懸液，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育.

1.2.5 MTT法測定脾淋巴細胞增殖

脾淋巴細胞培養(yǎng)48 h后，收集上清液，－20℃凍存.之后每孔加入MTT（5 g／L）35 μL，每組設8個復孔.37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸干液體，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），震蕩10～15 min使紫色結晶充分溶解，用酶標儀測定A490值.

1.2.6 脾淋巴細胞上清液中細胞因子的檢測

96孔板中分別加入50 μL的捕獲抗體，4℃過夜；次日用洗滌緩沖液洗4次后分別加入70 μL封閉液，室溫封閉1 h；洗滌液洗滌4次，加入待測上清液，每板設2個空白對照孔，各加入50 μL DMEM不完全培養(yǎng)液，室溫2 h；洗滌緩沖液洗4次，加入相應的檢測抗體，室溫下孵育1 h；洗滌緩沖液洗滌3次，加入50 μL辣根過氧化物酶標記的卵白素，室溫下孵育45 min；用洗滌液清洗5次后，加入酶作用底物，室溫孵育15～20 min底物顯色后，加入50 μL終止液，測定A450值.

1.2.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 發(fā)病情況

EAE組小鼠從d11p.i.開始陸續(xù)發(fā)病，逐漸出現(xiàn)飲食量及活動量減少、反應遲鈍等，發(fā)病當日體重明顯下降，臨床表現(xiàn)先是出現(xiàn)尾部肌張力低下，繼而進展為雙側后肢無力甚至癱瘓，不能主動翻身，d18p.i.左右癥狀達高峰，平均臨床癥狀評分（2.571±0.690），發(fā)病率達85%.與EAE組相比，治療組小鼠起病晚，高峰期延遲，癥狀較輕，發(fā)病率低，體重減輕程度明顯改善.見表1.

2.2 病理改變：

HE染色顯示EAE組小鼠脊髓炎性浸潤主要分布在脊髓前角白質、灰白質交界區(qū)及正中裂血管周圍，浸潤細胞以淋巴細胞和中性粒細胞為主，尤以腰膨大炎性浸潤比較明顯，而Fasudil hydrochloride治療組炎性浸潤明顯減輕（圖1）.EAE組髓鞘染色可見髓鞘稀疏，不連續(xù)，而治療組髓鞘脫失表現(xiàn)有明顯改善（圖2）.佐劑組小鼠脊髓未見明顯異常改變.

表1 各組小鼠發(fā)病情況

2.3 脾淋巴細胞的增殖情況

d18～20檢測各組脾淋巴細胞的增殖情況.與對照組相比，EAE組脾臟淋巴細胞增殖作用明顯（P＜0.01）；Fasudil hydrochloride治療組淋巴細胞增殖反應明顯受抑制（P＜0.01，表2）.

2.4 脾淋巴細胞上清液中細胞因子的檢測結果

對各組脾淋巴細胞分泌的細胞因子INF－γ、IL－17、IL－10進行檢測，發(fā)現(xiàn)EAE組三種細胞因子的分泌均有增加，鹽酸法舒地爾明顯抑制IFN－γ、IL－17的分泌，并且促進IL－10的分泌（圖3）.

圖1 HE染色情況（脊髓HE染色：A、B、C圖×10，D、E、F圖×40）

圖2 髓鞘染色情況（脊髓髓鞘染色：1、2、3圖×10，4、5、6圖×40）

表2 MTT法測定脾淋巴細胞增殖結果

圖3 各組脾臟淋巴細胞上清液中INF－γ、IL－17、IL－10水平

3 討論

EAE在整個發(fā)生發(fā)展過程中存在著Th1／Th2細胞偏移，并以激活的Th1細胞占優(yōu)勢的現(xiàn)象.Th1／Th2細胞分泌的細胞因子網(wǎng)絡在效應T細胞增殖、分化和作用過程中起著關鍵作用[5].Th1細胞主要分泌IFN－γ、TNF－α等細胞因子，促進細胞介導的免疫應答，引發(fā)和加重EAE；Th2細胞則主要分泌IL－00、HD－4等細胞因子；對EAE有抑制作用[6].IL－1是由IL－23（p40p19）誘導生成的Th17細胞分泌，在MS／EAE中，IL－23／Th17軸起著更為重要的角色.Kebir等[7]發(fā)現(xiàn)MS病人血腦屏障（bloodbrain）n－barrier，BBB）細胞表達IL－17和IL－23受體并且體內外IL－17和IL－23均可以誘導BBB內皮細胞表達ACL2，CCL2與Th17細胞表面相應的趨化因子CCR2受體結合后，破壞緊密連接，有效地通過BBB進入CNS，引起CNS炎性改變.

Rho／Rho激酶（Rock）信號途徑是機體各組織中普遍存在的一條信號轉導通路，其參與調控多種細胞的增殖、分化、運動、移行以及生成和死亡等.Rho／Rock信號途徑伴隨多種炎癥介質和細胞因子受體后耦聯(lián)機制的活化而激活，通過激酶級聯(lián)反應直接參與細胞內微絲骨架構型的調控，通過改變細胞骨架構型而介導多種刺激，是細胞行為改變最直接的信號通路.Rho激酶能被多種細胞因子（cytokine，CK）活化，有研究表明，經(jīng)Rock－Ⅱ特異抑制劑——法舒地爾治療EAE后，IL－17和Th1類CK，如IFN－γ等明顯減少，而Th2類CK，如IL－4，IL－5有輕微的增加，導致IFN－γ／IL－4率明顯降低，這些結果和其他Rock抑制劑如Y－27632的結果一致.本研究顯示，在EAE發(fā)病高峰期培養(yǎng)脾淋巴細胞，檢測三組上清液中INF－γ、IL－17、IL－10的分泌，發(fā)現(xiàn)法舒地爾治療組與EAE組相比INF－γ的分泌顯著下調，IL－17分泌也有下調但不如 INF－γ明顯，IL－10的分泌顯著上調，推測Rock－Ⅱ特異抑制劑法舒地爾參與EAE發(fā)病高峰期Th1／Th2細胞向Th2的偏移.

本實驗中應用Rock－Ⅱ特異抑制劑——Fasudil hydrochloride（d6p.i.給予腹腔注射，連續(xù)給藥14 d）可以顯著降低由MOG35－55誘導的EAE小鼠的發(fā)病率，改善臨床癥狀，減輕炎性浸潤及髓鞘脫失等病理變化，推測可能是與Rock－Ⅱ特異抑制劑對外周脾臟淋巴細胞增殖的直接抑制和T淋巴細胞的轉化有關.Sun等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)，直接應用Fasudil對EAE有很好的治療效果，不僅使外周特異性淋巴細胞減少，而且下調了IL－17和 IFN－γ／IL－4的比率.Rho／Rock信號途徑與MS和EAE的發(fā)病機制密切相關，但是現(xiàn)有的資料仍不能清晰地證明其分子基礎和細胞靶點.這些問題的闡明將對探討EAE和MS的發(fā)病機制和尋找新的治療方法具有特別重要的意義.

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Abstract：ObjectiveTo investigate the suppressive effect and the possible mechanism of Fasudil hydrochloride on Experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）mice.MethodsAll female C57BL／6 mice were divided by average body weight into EAE group，F(xiàn)asudil hydrochloride treated group and Adjuvant group.Mice in EAE and treated groups were immunized subcutaneously with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide（MOG35－55）.At the same time，adjuvant group was injected with normal saline instead of MOG35－55.Fasudil hydrochloride was intraperitoneally injected in the dosage of 50 mg（kg·d）in treated group on day 6 post－immunization（p.i），and mice in EAE and adjuvant group injected with normal saline as control.Manifestations of each groups were observed and compared.On day 18p.i，splenic lymphocytes were isolated under asepsis in each group respectively，and splenic lymphocyte suspensions were prepared.The proliferation assay was determined by MTT，and the supernatants were harvested for the detection of INF－γ，IL－17 and IL－10 by ELISA.ResultsFasudil hydrochloride may significant ameliorate symptoms of EAE mice，lessen inflammatory cell infiltration and demyelination，suppress the secretion of INF－γ，IL－17（P＜0.05）and promote the secretion of IL－10（P＜0.05）.ConclusionsFasudil hydrochloride can actively suppress EAE，which perhaps relates to downregulation of INF－γ，IL－17 and up－regulation of IL－10.

Key words：Fasudil hydrochloride；experimental autoimmune encephalomyelitis；interferon－γ；interleukin－17；interleukin－10

〔編輯 楊德兵〕

Effect and Mechanism of Fasudil Hydrochloride on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mice

DUAN Hui－jie1，2，GUO Min－fang1，YU Jie－zhong1，LIANG Li－yun1，MA Cun－gen1，2
（1.Institute of Brain Science，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009；2.Department of Neurology，the First Clinical Medical College，Shanxi Medical University，Taiyuan Shanxi，030001）

R744.5＋.1

A

1674-0874(2010)04-0053-05

2010－03－20

人事部2006年度回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目［國人廳發(fā)（2006）164號］；山西省自然科學基金［2008011082－1］；山西省回國留學人員科研基金［2007－50］；山西省基礎研究計劃項目（青年）［2009021041－2］

段惠潔（1981－），女，山西省新絳縣人，在讀碩士，研究方向：神經(jīng)免疫學；*馬存根，博士，教授，通信作者.