骨髓間充質(zhì)干細胞移植對缺血性腦卒中大鼠的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶的影響

郭繼東, 王 月, 信 宏

目前關(guān)于臨床上治療缺血性腦卒中的方法有早期溶栓、保護腦細胞及抗血小板聚集等方法,有效的治療措施只有極早期的溶栓治療,但是很少有患者受益。近年發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMCs)可以分化為神經(jīng)細胞[1],使其成為治療缺血性腦卒中研究的熱點。關(guān)于其機制的研究較多的集中于各類生長因子及營養(yǎng)因子,而對于信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)方面未見報道。故本研究欲觀察 BMCs移植對缺血性腦卒中大鼠的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的影響。

1 資料與方法

1.1 動物與試劑 健康幼年Wistar大鼠 5只,體重(120±10)g,用于提取 BMCs;健康成年Wistar大鼠 30只,體重(300±10)g,用于制作缺血性腦卒中模型。所有大鼠均雌雄不限,且由吉林大學實驗動物中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自 Sigma公司,大鼠腦立體定位儀購自北京智鼠多寶公司;ERK免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 MSCs的分離、培養(yǎng)及收集 聯(lián)合采用密度梯度離心及貼壁法分離培養(yǎng)大鼠 MSCs,原代培養(yǎng)達 80%以上融合后按 1∶3傳代培養(yǎng),選取生長良好的 1、2、3代細胞,用 0.25%胰蛋白酶室溫消化 5m in,用含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化,PBS清洗,1000r/min離心,每次 5min,共離心 3次,然后收集培養(yǎng)的大鼠 MSCs用于移植。

1.2.2 大鼠分組及缺血性腦卒中模型制作 30只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和 BMCs移植組,每組10只。采用Longa[2]方法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。麻醉清醒后 2h采用Longa[2]的評分方法進行評分。0分和 4分的動物棄之不用。假手術(shù)組只行開顱術(shù),不凝閉大腦中動脈。

1.2.3 MSCs的移植 于造模術(shù)后 1w行細胞移植實驗。在腦梗死側(cè)(右側(cè))殼核區(qū)于立體定向儀定位下進行直接注射移植。移植組注射MSCs懸液 5μl,其他兩組大鼠于相同部位注射同等量不含細胞的0.1mol/L PBS。

1.3 觀察指標

1.3.1 神經(jīng)功能損傷程度評分(NSS) 分別于造模前、移植前及移植后第 4周對各組動物進行NSS,評分標準參考Chen等[3]方法,主要觀察運動、感覺功能、平衡能力及生理反射能力;總分為 18分,正常為 0分,分值越高其神經(jīng)損害程度越嚴重。

1.3.2 免疫組化染色 移植后第4周,每組取5只處死大鼠取腦組織。腦組織用生理鹽水和多聚甲醛先后經(jīng)心灌注固定,石蠟包埋,冠狀切片。嚴格按照免疫組化試劑盒說明書操作進行腦組織免疫組化染色檢測ERK蛋白表達。顯微鏡下任選 5個 400倍視野計數(shù)陽性細胞。

1.3.3 腦梗死體積檢測 移植后第 4周,各組剩余大鼠處死,取腦,于 -20℃冷凍 20min,冠狀切片,由前到后,共 5張切片,置 2%TTC液中,37℃避光孵育 30m in,梗死區(qū)不著色,正常腦組織染成紅色,隨即采用 40g/L甲醛固定,根據(jù)蒼白區(qū)觀察梗死灶范圍,依據(jù)公式計算梗死面積[4]。

1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差表示,應用 SPSS 13.0進行方差分析和 t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物數(shù)量統(tǒng)計 假手術(shù)組無動物缺失,模型組因麻醉過量死亡 2只,BMCs移植組因術(shù)后感染死亡 1只,其余大鼠均進入結(jié)果統(tǒng)計。

2.2 各組動物NSS 造模前各組動物 NSS比較無顯著差異(P＞0.05);移植前,模型組及移植組 NSS評分均較假手術(shù)組增高明顯(P＜0.05),但兩組間無顯著差異(P＞0.05);移植后,模型組最高,其次為移植組,最低者為假手術(shù)組,3組間均有顯著差異(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組 NSS比較

2.3 免疫組化 假手術(shù)組ERK陽性細胞數(shù)為 13.42±6.91,明顯低于模型組(120.33±30.52)和 BMCs移植組(35.85±12.64)(P＜0.05),BMCs移植組明顯高于模型組(P＜0.05)。

2.4 腦梗死體積 假手術(shù)組未見梗死灶,模型組梗死體積為(53.27±20.64)mm3;BMCs移植組梗死體積為(30.31±12.95)mm3,二者差異顯著(P＜0.05)。

3 討 論

成年哺乳動物的神經(jīng)細胞缺乏再生能力,其損傷后很難恢復,故缺血性腦卒中后如果不能在第一時間改善其血供,將導致缺血區(qū)神經(jīng)細胞的死亡。干細胞移植是近年醫(yī)學上乃至生命科學領域的研究熱點。但是胚胎干細胞移植存在倫理、法律及取材等方面的不便,故移植治療的應用方面受到很大限制。BMCs是多能細胞,具有多項分化的潛能,在一定誘導條件下可分化為多種造血外組織,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層發(fā)育來源的組織細胞,如成骨細胞、脂肪細胞以及神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等[5,6]。尤其是神經(jīng)元的分化方向,使其具有了強大的吸引力,很多研究者都嘗試將其用于治療各類神經(jīng)疾病,尤其用于治療缺血性腦卒中的研究近年更為廣泛。研究人員考慮到 BMCs具有高度可塑性,且取材方便、免疫排斥反應弱,少受倫理學制約,移植方便等特點,將其應用于腦梗死的治療。

本研究成功地將 BMCs移植入梗死灶,結(jié)果表明,模型大鼠的神經(jīng)功能缺損得到明顯改善,其梗死的大腦面積也明顯減小,考慮與BMCs分化為神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞有關(guān),同時我們未觀察到 BMCs移植對腦組織結(jié)構(gòu)的損傷。BMCs移植的療效顯著。

腦缺血時組織低氧缺氧,細胞可以表現(xiàn)為壞死或凋亡,同時細胞也會啟動修復機制對其缺氧損傷進行修復。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)傳導途徑是與細胞增殖,分化及凋亡控制密切相關(guān)的細胞信號傳導途徑,ERK作為 MAPK的家族成員之一,可以介導細胞增殖、分化并促進細胞的存活。正常生理條件下 ERKs就存在于動物腦內(nèi),可被神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子等多種信號激活,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可通過基因表達、蛋白合成等影響神經(jīng)細胞增殖分化、突觸可塑性、軸突生長等,并且參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程[7]。但是關(guān)于 ERK在缺血性腦卒中的發(fā)病過程中到底起到保護還是損傷作用各家說法不一[8～10]。

本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過造模以后,大鼠腦組織中 ERK明顯增多,說明ERK通過介導炎性反應和氧化應激反應促進缺血缺氧時的神經(jīng)細胞的死亡與凋亡[11]。但是移植入BMCs后,檢測結(jié)果顯示,大鼠腦內(nèi) ERK陽性細胞數(shù)量明顯減少,表明BMCs的移植抑制了 ERK通路活性,下調(diào) ERK蛋白的表達,保護缺血缺氧的神經(jīng)細胞免受炎性反應和氧化應激反應的損傷,保護神經(jīng)細胞的功能,從而達到治療缺血性腦卒中的目的。

[1]Sanchez-Ramos JR.Expression of neuralmarkers in human umbilical cord blood[J].JNeuroscience Res,2002,69：880-893.

[2]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebralartery cclusionwithout craniectomy in rats[J].Stroke,1989,2(1)：84-91.

[3]Chen JL,Yi Li,Wang L,etal.Therapeutic benefit of intravenous adm inistration of bone marrow stromal cells after cerebral ischem ia in rats[J].Stroke,2001,189(1～ 2)：49-57.

[4]Kashiwagi F,Katawama Y,Suzuki S,etal.Effect of glycerol administration on experimental cerebralischemia：Part 1.Studies on lipid peroxides,prostaglandins,brain edema,and brain metabolites[J].No To Shinkei,1988,40(2)：179-85.

[5]Tao H,Rao R,Ma DD,etal.Cytokine induced stable neuronal differentiation of human bonemarrow mesenchymal stem cells in a serum/feeder cell free condition[J].Development,Growth and Differentiation,2005,47(6)：423-433.

[6]Long X,O lszewski M,Huang W,etal.Neural cell differentiation in vitrofrom adult human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Stem Cellsand Development,2005,14(1)：65-69.

[7]Chang L,Karin M.Mammalian MAP kinase signalling cascades[J].Nature,2001,410(6824)：37-40.

[8]Wang Z,Chen X,Zhou L,etal.Effectsofextracellular signal-regulated kinase(ERK)on focal cerebral ischemia[J].Chin Med J(Engl),2003,116(10)：1497-1503.

[9]Henriksson M,Stenman E,Vikman P,etal.MEK 1/2 inhibition attenuates vascular ETA and ETB receptor alterations after cerebral ischaem ia[J].Exp Brain Res,2007,178(4)：470-476.

[10]Yang JP,Lia XF,Liu HJ,etal.Extracellular signal-regulated kinase involved in NGF/VEGF induced neuroprotective effeet[J].Neurosci Lett,2008,434(2)：212-217.

[11]嚴洪新,徐 恩.細胞外信號調(diào)節(jié)激酶與缺血性腦卒中[J].現(xiàn)代醫(yī)學,2010,38(4)：427-430.