短暫腦缺血發(fā)作后繼腦梗死患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化及意義

李龍宣, 趙 斌, 唐榮華, 柯俊龍

短暫腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack,TIA)是一種突發(fā)的、短暫性的神經(jīng)功能缺損,在腦梗死中約有 15%患者在發(fā)病前短期內(nèi)(＜1月)存在 TIA。發(fā)作頻繁、持續(xù)時(shí)間長的 TIA更是腦梗死的特級(jí)警報(bào)。然而大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明[1,2],TIA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞可起保護(hù)作用,不僅能使間隔一定時(shí)間以后的嚴(yán)重腦缺血所致的缺血性損傷的體積縮小,而且可使神經(jīng)功能損害減輕,此即所謂“缺血耐受”(ischemic tolerance,IT)現(xiàn)象,事先給予反復(fù)短暫缺血預(yù)處理能提高腦組織對(duì)后續(xù)缺血的耐受性。臨床資料也顯示[3],同側(cè) TIA對(duì)其后繼腦梗死具有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)心、腦血管狹窄或閉塞后,其缺血區(qū)可建立側(cè)支循環(huán)以改善缺血[4,5]。有證據(jù)表明內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial p rogenitor cells,EPCs)的增加在心肌缺血保護(hù)中起重要作用,而且不充分冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的形成與循環(huán) EPCs數(shù)量減低相關(guān)[5]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些 EPCs主要來源于骨髓,是一種能直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,當(dāng)血管損傷時(shí),骨髓EPCs被動(dòng)員至外周血,參與血管內(nèi)皮修復(fù)過程[6]。業(yè)已發(fā)現(xiàn),急性腦梗死患者外周血循環(huán) EPCs的增加與良好預(yù)后相關(guān),并與腦梗死體積呈負(fù)相關(guān),這提示循環(huán) EPCs參與了腦梗死后的神經(jīng)修復(fù)[7]。基于上述發(fā)現(xiàn),我們推測(cè) TIA也有可能動(dòng)員 EPCs入血,誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)而發(fā)揮對(duì)后續(xù)腦梗死的保護(hù)作用。如果我們的假說成立,那么有或無TIA史的腦梗死患者早期外周血中 EPCs差別如何?有 TIA史的后續(xù)腦梗死患者早期 EPCs數(shù)量與神經(jīng)功能缺損程度以及腦梗死體積的相關(guān)性如何?是什么因素刺激 TIA患者 EPCs釋放入血?目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道,因此有必要展開進(jìn)一步的研究。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 全部病例選取我院與武漢同濟(jì)醫(yī)院2008年5月～2010年10月神經(jīng)科住院患者,均患有前循環(huán)腦梗死,符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定標(biāo)準(zhǔn),并排除復(fù)發(fā)性腦梗死。男 37例,女 21例,年齡為 42～73歲。根據(jù)發(fā)病前有無同側(cè) TIA(均有 2～3次同側(cè)前循環(huán) TIA史)分為 TIA組(26例)和非 TIA組(32例)。患者均在發(fā)病 24h內(nèi)入院,未服用他汀類、促紅細(xì)胞生成素藥物 2個(gè)月以上。均剔除外傷、潰瘍、重度視網(wǎng)膜病、近期外科手術(shù)、炎癥、腫瘤等影響 EPCs的疾病,近 3個(gè)月無急性心肌梗死、心絞痛發(fā)生和腦出血史,無肝、腎功能不全者。所有患者入院時(shí)盡快行頭部 CT掃描,發(fā)病 24～48h內(nèi)行 MRI(包括 MRI平掃與 DWI)檢查以明確診斷。選取 16例健康志愿者為正常對(duì)照,男 10例,女 6例,年齡 45～72歲,無高血壓、血脂異常、腦卒中史、糖尿病、心血管疾病、肝腎疾病和感染性疾病史。各組患者及對(duì)照組年齡、性別、是否伴高血壓、糖尿病、心肌缺血、高膽固醇血癥以及吸煙、濫用酒精情況以及體重指數(shù)情況(見表1)。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分 根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale Score,NIHSS)對(duì)各組患者入院時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失程度評(píng)分。

1.2.2 梗死體積測(cè)定 患者在發(fā)病第 5天時(shí),復(fù)查頭部 CT測(cè)定腦梗死灶體積,測(cè)量低密度灶的長寬厚 3徑,根據(jù) Pullicino提出的腦梗死灶體積計(jì)算方法：腦梗死灶體積(cm3)=長 ×寬 ×CT掃描陽性層數(shù) ×π/6,如有數(shù)個(gè)病灶其體積累加即為總體積。

1.2.3 循環(huán) EPCs的檢測(cè)[8,9]選取在發(fā)病24h內(nèi)有或無同側(cè) TIA史的首次前循環(huán)腦梗死患者或健康志愿者,以規(guī)格為 20的靜脈穿刺套管針抽取肘前靜脈血 15m l,收集于含 3.8%的緩沖肝素鈉的采血管中。丟棄最初的 2m l血以盡量減少來自血管壁穿刺傷口部位內(nèi)皮細(xì)胞的污染。所有的血液樣本在采集后 1h內(nèi)處理。采用 Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。以 CD34和 KDR雙陽性細(xì)胞作為 EPCs標(biāo)記。在 100μl外周血單個(gè)核細(xì)胞(含 1×106個(gè)細(xì)胞)中加入 10μl Fc受體阻斷劑(MiltenyiBiotec公司)孵育 10min以抑制非特異性結(jié)合。之后加入 FITC標(biāo)記的 CD34小鼠抗人單克隆 IgG1抗體(BD Pharm ingenTM公司)以及 APC標(biāo)記的小鼠抗人 KDR單克隆 IgG1抗體各 10μl(R＆D Systems公司),避光 4℃孵育 30m in。同型對(duì)照為FITC標(biāo)記和 APC標(biāo)記的小鼠 IgG1(BD Biosciences公司)。之后將細(xì)胞漂洗 3次以洗掉未結(jié)合抗體,最后將細(xì)胞重懸于 400μl熒光激活的流式分選液中。采用 BD公司 FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),以 Cell Quest軟件進(jìn)行流式細(xì)胞分析。在前向角散射光和側(cè)向角散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖上對(duì)單個(gè)核細(xì)胞群設(shè)窗,每次分析每個(gè)樣本收集細(xì)胞數(shù) 5×105個(gè),以此群體統(tǒng)計(jì) CD34+KDR+細(xì)胞相對(duì)于總單個(gè)核細(xì)胞的百分?jǐn)?shù),每個(gè)樣本重復(fù) 2次,取均值代表該樣本 CD34+KDR+細(xì)胞相對(duì)百分?jǐn)?shù),即代表外周血循環(huán) EPCs的數(shù)量。

1.2.4 血清 VEGF水平檢測(cè) 每例均取外周肘前靜脈血 3ml,注入干凈試管中,4℃放置 30min,離心 10min(3000rpm),取上層血清按順序標(biāo)號(hào),置-80℃保存,同批行盲法測(cè)定。用雙抗體夾心酶聯(lián)吸附免測(cè)定法(ELISA)測(cè)血清 VEGF水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用 t檢驗(yàn)或方差分析。Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)用于相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)分析采用 SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包完成。P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組 NIHSS評(píng)分、腦梗死體積、外周血循環(huán) EPCs數(shù)量與血清 VEGF含量變化 入院時(shí),TIA組 NIHSS評(píng)分明顯低于非 TIA組(t=3.123,P=0.0028),表明 TIA后續(xù)腦梗死的嚴(yán)重程度較無 TIA史的腦梗死輕。在發(fā)病第 5天,TIA組腦梗死體積比非 TIA組明顯減小(t=3.796,P=0.0004),提示TIA能減小后續(xù)腦梗死的梗死體積;非 TIA組患者外周血循環(huán) EPCs數(shù)量比正常對(duì)照組有上升趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(q=1.614,P＞0.05);TIA組患者外周血循環(huán) EPCs數(shù)量與非 TIA組和正常對(duì)照組相比,均顯著升高(與非 TIA組相比,q=7.017,P＜0.001;與正常組相比,q=7.386,P＜0.001)。與正常對(duì)照組比較,非 TIA組和 TIA組患者血清 VEGF含量均顯著增高(非 TIA組,q=5.178,P＜0.001;TIA組,q=10.78,P＜0.001),而 TIA組與非 TIA組比較,其血清 VEGF含量顯著增加(q=6.969,P＜0.001)(見表2)。

2.2 EPCs數(shù)量與 NIHSS評(píng)分、腦梗死體積、以及血清 VEGF濃度的相關(guān)性 將 TIA組和非 TIA組患者外周血循環(huán) EPCs數(shù)量與入院時(shí) NIHSS評(píng)分、腦梗死體積(cm3)、以及血清 VEGF含量(pg/ml)進(jìn)行 Spearman等級(jí)相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)有或無 TIA史腦梗死患者循環(huán) EPCs數(shù)量與神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度或腦梗死體積均成負(fù)相關(guān),在 TIA組內(nèi) EPCs數(shù)量與血清 VEGF含量呈正相關(guān)(見表3)。

表1 各組病例一般情況比較

表2 各組NIHSS評(píng)分、腦梗死體積、外周血循環(huán) EPCs數(shù)量、血清與 VEGF含量變化

表3 循環(huán) EPCs數(shù)量與 NIHSS評(píng)分、腦梗死體積及血清 VEGF含量的相關(guān)性分析

3 討 論

在本研究中,我們對(duì)有或無 TIA史的腦梗死患者入院時(shí)神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度以及梗死體積的變化進(jìn)行了觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn) TIA組患者神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分及梗死體積明顯小于非 TIA組,這再次證實(shí)了 TIA能對(duì)后續(xù)腦梗死發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究旨在觀察 TIA后繼腦梗死患者外周血循環(huán) EPCs變化,探討 TIA是否增加對(duì)循環(huán) EPCs的動(dòng)員而發(fā)揮對(duì)后續(xù)腦梗死的保護(hù)作用。雖然目前國內(nèi)外有關(guān)外周血循環(huán) EPCs在急性缺血性卒中中變化的研究不少,但深入比較循環(huán) EPCs在有或無 TIA史的腦梗死患者早期外周血中變化的研究尚未見報(bào)告。本研究以流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期外周血循環(huán)EPCs數(shù)量,因此如何選擇循環(huán) EPCs的表面標(biāo)記物是本研究的關(guān)鍵。關(guān)于 EPCs表面標(biāo)記物的選擇,目前沒有定論。有學(xué)者指出,EPCs至少表達(dá)一個(gè)未成熟性的標(biāo)記抗原,另外還需攜帶有內(nèi)皮細(xì)胞的特征。在推薦的 3種 EPCs的標(biāo)記抗原 CD34、CD133與KDR中,CD34是一種可表達(dá)在造血干細(xì)胞上的粘附分子,它被認(rèn)為是典型未成熟性的標(biāo)記抗原;CD133是一個(gè)有著未知功能的表面抗原,用來確定比 CD34更加早期的未成熟的祖細(xì)胞;KDR代表 VEGFR2,預(yù)示著早期的內(nèi)皮細(xì)胞分化。由此 CD34+CD133+KDR+和 CD133+KDR+細(xì)胞代表更為早期的未成熟EPCs,如那些剛從骨髓中動(dòng)員出來的 EPCs,一旦進(jìn)入血中 EPCs便逐漸丟失 CD133,因此 CD34+KDR+細(xì)胞成為了血中主要的循環(huán) EPCs[10]。在我們的研究中,以 CD34+KDR+細(xì)胞作為 EPCs的標(biāo)記,對(duì)有或無 TIA史的首次腦梗死患者和正常對(duì)照組的早期外周血循環(huán) EPCs進(jìn)行流式細(xì)胞分析,發(fā)現(xiàn)非 TIA組患者外周血循環(huán) EPCs數(shù)量比正常對(duì)照組有上升的趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;TIA組患者外周血循環(huán) EPCs數(shù)量與非 TIA組和正常對(duì)照組相比,均顯著升高,這提示 TIA增加了對(duì)循環(huán) EPCs的動(dòng)員,提高了外周血循環(huán) EPCs的數(shù)量。就現(xiàn)存文獻(xiàn)看,有關(guān)循環(huán) EPCs在腦梗死患者外周血中變化的結(jié)果不一。與正常組比較,有明顯下降的[11,12]、有顯著上升的[13]、也有無明顯改變的[9]。造成這種檢測(cè)結(jié)果差異變化的原因很多,與病例的觀察納入標(biāo)準(zhǔn)(有些病例不除外先前有 TIA或腦梗死病史,病前使用過他汀類藥物治療)、患病后血液標(biāo)本采集的時(shí)間點(diǎn)、樣本的處理與EPCs的分離、EPCs表面標(biāo)記物選擇及檢測(cè)手段方法不同有關(guān)。另外,我們?cè)谙嚓P(guān)分析中發(fā)現(xiàn)：有或無TIA史的腦梗死患者循環(huán) EPCs數(shù)量與神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度或腦梗死體積均成負(fù)相關(guān),這表明外周血循環(huán) EPCs數(shù)量關(guān)系到急性缺血性卒中的嚴(yán)重程度,升高的循環(huán) EPCs具有腦保護(hù)作用。經(jīng) TIA刺激后循環(huán) EPCs從骨髓動(dòng)員入血,它很可能參與了腦內(nèi)的血管新生或重塑,從而減輕了后續(xù)腦梗死造成的損傷。

業(yè)已發(fā)現(xiàn)冠心病患者心肌缺血后使循環(huán) EPCs水平明顯增加,并發(fā)現(xiàn)循環(huán) EPCs增加與血清 VEGF升高緊密相關(guān)[14]。由此我們進(jìn)一步檢測(cè)了腦梗死患者血清 VEGF含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn) TIA與非 TIA組患者早期血清 VEGF含量均顯著高于正常對(duì)照組;并發(fā)現(xiàn) TIA組血清 VEGF含量比非 TIA組明顯增加,這表明 TIA促進(jìn)了 VEGF在外周血中表達(dá)。此外,在 TIA組內(nèi) EPCs數(shù)量與血清 VEGF含量呈正相關(guān),提示循環(huán) EPCs在 TIA后續(xù)腦梗死患者外周血中增加很可能受 VEGF調(diào)節(jié)。另外我們還注意到無 TIA史的首次腦梗死患者早期血清 VEGF含量顯著高于正常對(duì)照組,其外周血中循環(huán) EPCs雖比正常組有上升趨勢(shì)卻無明顯增加,而且其循環(huán) EPCs與血清VEGF含量無顯著相關(guān)。這提示血管閉塞引起的腦梗死在缺血早期就可誘導(dǎo) VEGF含量迅速增加,而且血中 VEGF變化早于循環(huán)EPCs。之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象,可能存在以下原因：缺血誘導(dǎo)的 VEGF增加可動(dòng)員 EPCs從骨髓入血[14],但 EPCs從骨髓入血這一過程需要一段時(shí)間,有 TIA史的后續(xù)腦梗死因?yàn)榻?jīng)過一段時(shí)間的預(yù)刺激,所以血中循環(huán) EPCs數(shù)量相對(duì)較高;而無 TIA史的腦梗死雖有血清 VEGF的急速增加,但缺少一段時(shí)間的動(dòng)員反應(yīng),所以血中循環(huán)EPCs數(shù)量相對(duì)較低。

總之,本研究提示 TIA增加了對(duì)循環(huán) EPCs的動(dòng)員,提高了外周血循環(huán) EPCs數(shù)量,EPCs增加很可能受 VEGF調(diào)節(jié),而且外周血循環(huán) EPCs數(shù)量關(guān)系到急性缺血性卒中的嚴(yán)重程度,這可能是 TIA發(fā)揮對(duì)后繼腦梗死保護(hù)作用的機(jī)制之一。

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