利用流式熒光原位雜交法測定細胞端粒長度

黃 馨，石桂英，陳顯達，鞠振宇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

利用流式熒光原位雜交法測定細胞端粒長度

黃 馨，石桂英，陳顯達，鞠振宇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

目的 建立利用流式熒光原位雜交法檢測細胞端粒長度的技術(shù)方法。方法 以端粒酶敲除的G3小鼠和同齡野生型小鼠為檢測對象，分離其外周血中的單個核細胞后與肽核酸熒光探針雜交，用流式細胞儀采集和分析其端粒長度，分別用熒光原位雜交方法和SYBR Green熒光定量PCR方法驗證其準(zhǔn)確性。結(jié)果 流式熒光原位雜交法測定G3小鼠細胞端粒相對長度與C57BJ/6野生型小鼠相比為0.5345，熒光定量PCR測定端粒相對長度為0.5717，結(jié)果基本一致。結(jié)論 流式細胞術(shù)與原位雜交方法結(jié)合起來檢測細胞端粒的平均長度可靠易行，對單個核細胞端粒平均長度的檢測有較高的實用性。

流式熒光原位雜交法;端粒;PNA探針

端粒是真核生物染色體線性DNA分子末端的特殊結(jié)構(gòu)，通常由簡單的富含TG的重復(fù)DNA序列及相關(guān)蛋白質(zhì)組成，主要功能是維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復(fù)制的完整性。已知端?？s短是引起細胞衰老和生物衰老的分子機制之一，大量與端粒相關(guān)的研究已見諸報道，而測量端粒的長短則成為研究端粒特性的重要手段之一。Rufer［1］首次采用流式熒光原位雜交法(flow fluorescent in situhybrid-ization，F(xiàn)low-Fish)測定端粒長度，該法靈敏簡單，操作快捷，重復(fù)性好。為研究該方法的可行性，本實驗采用Flow-Fish方法對不同小鼠的端粒長度進行測定，并通過原位定量熒光雜交(quantitative fluorescent in situ hybridization，Q-Fish)方法和SYBR Green定量RCR方法進行了驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:肽核酸(Peptide nucleic acid，PNA)探針購自韓國 Panagene公司，序列為 CCC TAA CCC TAA CCC TAA，C末端 FITC熒光標(biāo)記;SYBR Green Mix購自東洋紡公司;右旋糖購自美國Sigma公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗動物:C57BJ/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心［SCXK-(軍)2007-004］;Terc－/－G3小鼠為本實驗室SPF級動物房繁殖。

1.1.3 主要儀器:ABI StepOne實時定量 PCR儀;BD FACS Aria流式細胞儀;ZEISS LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡。

1.2 試劑配制

1.2.1 紅細胞裂解液:0.83%NH4Cl，0.22 μm 濾膜過濾后4℃保存;

1.2.2 雜交緩沖液:2mL 100mmol/L Hepes+200 μL10%牛血清白蛋白，加入5%右旋糖至終體積20mL;

1.2.3 染色緩沖液(staining medium，SM):PBS+5%胎牛血清+1%P/S

1.2.4 染色清洗液Ⅰ:341.3mL H2O+32.5mL 1 mol/L Tris pH7.1+16.25mL 10%牛血清白蛋白+16.25mL 10% 吐溫20+1218.8mL甲酰胺，混勻后分裝至1.5mL離心管，－20℃保存不超過2個月;

1.2.5 染色清洗液Ⅱ:374mL 5%右旋糖+42.5mL 100mmol/L Hepes+4.25mL 10%牛血清白蛋白+4.25mL 10%吐溫20，混勻后分裝至1.5mL離心管，4℃保存不超過2個月;

1.2.6 雜交混合液:PNA探針溶解于H2O和二甲基甲酰胺的等體積混合液，濃度為1 μg/μL(如不能充分溶解，可在50℃～80℃加熱片刻);在50mL離心管內(nèi)加入40.5mL去離子甲酰胺+1.08mL 1 mol/L Tris pH7.1+7.92mL H2O，充分混勻后各取24.25mL轉(zhuǎn)移至另兩個50mL離心管內(nèi)，一個管加入 750 μL 1 μg/μL PNA 探針溶液輕輕搖晃混勻，另一個管加入750 μL H2O/二甲基甲酰胺混合液混勻作為空白對照;在干凈燒杯中加入3.72mL H2O+1.67mL 1 mol/L Tris pH7.1+1.67mL 1 mol/L NaCl+8.37mL 10%牛血清白蛋白+62.7mL去離子甲酰胺，充分混勻后各取38.6mL轉(zhuǎn)移至另外兩個燒杯中，分別標(biāo)記為“unst”和“tel”，在 unst管中加入413 μL空白對照，在 tel管中加入413 μL PNA探針稀釋液，充分混勻后分別轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，每管190 μL體積，－20℃保存不超過2個月;

1.3 準(zhǔn)備小鼠外周血單個核細胞

從小鼠尾部取外周血約 100 μL，加入 10 μL 0.1mmol/L EDTA抗凝;快速加入冰冷的0.83%NH4Cl 1mL，反復(fù)吹打混勻，室溫放置10 min;2000 r/min離心5 min，小心棄上清;用SM調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，分裝至0.2mL PCR管中，每管 2×105個細胞;

1.4 雜交和抗體標(biāo)記

裝有細胞的 PCR管2000 r/min離心5 min，小心棄上清，使剩余液體體積在10 μL左右，用槍頭吹打混勻;每管中分別加入170 μL雜交混合液或空白雜交混合液，吹打混勻后室溫孵育10 min;將PCR管移至87℃水浴中孵育15 min，取出后室溫避光孵育120 min;將細胞懸浮液從PCR管中移至裝有900 μL染色清洗液Ⅰ的1.5mL離心管中，吹打混勻，于16℃以4000 r/min離心5 min;小心棄上清，使剩余液體體積在100 μL左右(液體過少的話容易丟失細胞)，吹打混勻;加入 1000 μL 染色清洗液 I，于16℃以4000 r/min離心5 min;小心棄上清，余100 μL液體;重復(fù)此步驟2次;將剩余液體吹打混勻，加入1000 μL染色清洗液Ⅱ，于16℃以2000 r/min離心5 min;小心棄上清，使剩余液體體積在20 μL左右;加入300 μL SM，吹打混勻后冰上孵育60 min。

1.5 流式細胞儀分析

采用美國BD公司生產(chǎn)的FACS Aria型流式細胞儀，激發(fā)光源為氬離子激光，激發(fā)波長為488 nm，檢測FITC熒光強度。端粒熒光定量即Flow-Fish值為實驗樣品平均熒光強度。

1.6 Q-Fish方法測定端粒長度

同上制備小鼠外周血單個核細胞懸液，用SM調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，分裝至0.2mL PCR管中，每管2×105個細胞;裝有細胞的PCR管2000 r/min離心5 min后，小心棄上清，使剩余液體體積在10 μL左右，用槍頭吹打混勻;每管細胞加入100 μL新鮮配制的冰醋酸溶液(3∶1)，充分混勻;用無水乙醇清洗載玻片，干燥后用冰醋酸溶液處理，空氣干燥;每個載玻片置一滴細胞懸液，67℃溫箱孵育10 min;載玻片在PBS中浸洗15 min，轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中固定4 min;用PBS浸洗兩次，每次3 min;依次在70%、85%和100%冰乙醇中浸洗1 min以脫水;室溫晾干;每張載玻片加15 μL雜交混合液，覆上蓋玻片;80℃變性5 min;室溫避光孵育2 h;室溫下在染色清洗液Ⅰ中浸洗片刻以除去蓋玻片，染色清洗液Ⅰ中57℃孵育20 min;室溫下在染色清洗液Ⅱ中浸洗1 min;取出后稍晾干，每個載玻片加一滴SM，封片;激光共聚焦顯微鏡掃描，用488 nm激光器激發(fā)綠色熒光，掃描分辨率為1024×1024 pixel，計算機數(shù)據(jù)采集，數(shù)字成像。

1.7 SYBR Green定量PCR方法測定端粒長度

1.7.1 引物序列:端粒上游引物(tel1):5′-C GGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGT T-3′，下游引物 (tel2):5′-GGCTTGCCTTACCCT TACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′，Hbg 基因上游引 物:5′-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3′，下游引物:5′-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3′。

1.7.2 樣品的制備:將小鼠外周血單個核細胞樣品經(jīng)紫外分光光度計和電泳定質(zhì)定量后，稀釋為20 ng/μL，－20℃保存?zhèn)溆?

1.7.3 PCR的條件:95℃ 10 min激活Taq酶，開始循環(huán):95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。在60℃時檢測熒光。

1.7.4 數(shù)據(jù)收集和分析:主要由ABI StepOne實時定量PCR儀自帶軟件完成。通過軟件可以計算出所有樣品的熒光起始循環(huán)數(shù)(CT)。由于每經(jīng)過1個循環(huán)，PCR產(chǎn)物量翻倍，T/S比率為［2CT(telomere)/2CG(Hbg)］－1=2－△CT，相對 T/S 比率(一樣品相對于另一樣品的 T/S)為－2－(△CT1－CT2)=2－△△CT。根據(jù)此公式可計算出每個樣本的相對T/S值，該值與樣品DNA的相對端粒長度對應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀的分析結(jié)果

Terc－/－G3小鼠細胞平均熒光強度為 1216，空白對照為247;野生型C57BJ/6小鼠細胞平均熒光強度為2034，空白對照為224。經(jīng)計算，其差值分別為969和1813。設(shè)定野生型C57BJ/6小鼠外周血單個核細胞端粒長度為 N，則 Terc－/－G3小鼠外周血單個核細胞端粒相對長度為0.5345N(圖1)。

圖1 流式細胞術(shù)定量檢測小鼠外周血單個核細胞端粒長度Fig.1 Calculation of telomere length from flow Fish data

2.2 激光共聚焦顯微鏡成像結(jié)果

結(jié)果顯示野生型C57BJ/6小鼠細胞端粒染色后熒光強度明顯強于Terc－/－G3小鼠(圖2)。

2.3 定量PCR結(jié)果

設(shè)定野生型C57BJ/6小鼠外周血單個核細胞端粒長度為 N，如圖3所示，其△CT值為11.0039，G3小鼠的△CT值為9.9988。根據(jù)公式［2CT(telomere)/2CG(Hbg)］－1=2－△CT和－2－(△CT1－CT2)=2－△△CT，可計算出Terc－/－G3小鼠外周血單個核細胞端粒相對長度為0.5717N。

圖2 小鼠外周血單個核細胞的端粒長度檢測結(jié)果(綠色熒光)(FISH×400)Fig.2 Calculation of telomere length from Q-Fish data(green fluorescence)(FISH×400)

圖3 小鼠外周血單個核細胞端粒長度的定量PCR熒光曲線圖Fig.3 Amplification curve of fluorescence quantitative PCR of mice blood DNA

3 討論

已知端粒是由高度重復(fù)序列 TTAGGG組成［2］，其長度越長，在 FISH中結(jié)合的熒光素標(biāo)記的(CCCTAA)3PNA探針就越多，熒光強度越大。QFish中應(yīng)用了熒光素連接的肽核酸探針與細胞分裂中期的染色體端粒重復(fù)序列雜交，鏡下的每一個端粒點都與相應(yīng)的端粒長度相關(guān)，可用軟件分析其熒光強度從而得到其端粒相對長度。由于Q-Fish技術(shù)需要分裂中期的細胞標(biāo)本，并且不能對細胞進行選擇和分型，在一定程度上限制了其應(yīng)用。Flow-Fish技術(shù)的主要特點是將流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)和熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)結(jié)合起來，流式細胞儀檢測的細胞平均熒光強度即可表示端粒長度。本實驗中所選用的Terc－/－G3小鼠是敲除了端粒酶 RNA組分(telomerase RNA component，TERC)的模型小鼠。其后代表現(xiàn)出以約3－5kb的速率進行性端粒縮短［3］。本實驗中測得所用Terc－/－G3小鼠外周血單個核細胞端粒長度明顯短于正常野生型C57BJ/6小鼠，與文獻報道結(jié)果一致。

端粒長度測定的經(jīng)典方法是 Southern印跡法［4］，即通過DNA印跡雜交方法測定端粒限制性片段長度(telomere restriction fragment length，TRFL)，從此得到樣品中有核細胞的所有染色體的平均端粒長度。Southern方法操作復(fù)雜費時，而且需要大量樣品。另外由于實驗近交系小鼠細胞端粒長達10～40 kb，瓊脂糖凝膠電泳時難以得到分離較好的DNA條帶，直接影響了結(jié)果判讀。實時定量PCR技術(shù)是通過使用針對擴增DNA的熒光物質(zhì)，使DNA數(shù)量與檢測到的熒光強度成線性關(guān)系，得到DNA的S型擴增曲線。Cawthon等［5］研究表明用實時定量PCR測定的端粒長度與Southern雜交所測定的端粒長度顯著相關(guān)，本實驗室的前期研究也證明了這一點［6］。因此在用 Flow-Fish方法測定不同小鼠外周血單個核細胞端粒長度后，我們又用Q-Fish方法和RT-PCR方法對其進行了驗證。結(jié)果表明用Flow-Fish方法測定的端粒長度與后兩種方法所測定的端粒長度基本一致，這說明我們建立的Flow-Fish檢測端粒長度的方法是可靠的。

綜上所述，本實驗建立了穩(wěn)定可行的檢測細胞端粒長度的Flow-Fish實驗方法，本方法操作簡便，結(jié)果可靠，適用于單個核細胞端粒長度的檢測。

［1］Rufer N，Dragowska W，Thornbury G，et al.Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry［J］.Nat Biotechnol，1998，16:743－747.

［2］Blackburn EH.Telomeres［J］.Trends Biochem Sci，1991，16:378－381.

［3］Blasco MA，Lee HW，Hande MP，et al.Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA［J］.Cell，1997，91:25－34.

［4］Harley CB，F(xiàn)utcher AB，Greider CW.Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts［J］.Nature，1990，345:458－460.

［5］Cawthon RM.Telomere measurement by quantitative PCR［J］.Nucleic Acids Res，2002，30:e47.

［6］Yang ZW，Huang X，Ju ZY，et al.Short telomeres and prognosis of hypertension in a Chinese population［J］.Hypertension，2009，53:639－645.

Flow-Fish to Measure the Average Length of Telomeres

HUANG Xin，SHI Gui-ying，CHEN Xian-da，JU Zhen-yu
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)＆ Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College(PUMC);Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

Objective To test the Flow fluorescent in situ hybridization(Flow-Fish)method for measuring the length of telomeres.Methods The peripheral blood mononuclear cells were separated from 3rd generation telomerase knockout mice and wild-type mice.Cells were hybridized with PNA fluorescent probe and their telomere length was analyzed by flow cytometry.To confirm the Flow-Fish method we compared the measurement of telomere length obtained with the Flow-Fish method with that determined with conventional SYBR Green fluorescence quantitative PCR assay and QFish method.Results The relative telomere length measured by Flow-Fish was 0.5345，which was accordant to the results measured by fluorescence quantitative PCR assay(0.5717).Conclusion These results show that Flow-Fish can be used to measure specific nucleotide repeat sequences in single cells efficiently and easily.

Flow fluorescent in situ hybridization(Flow-Fish);Telomere;PNA probe

R-33

B

1671-7856(2010)07-0067-05

2010-04-09

十一五新藥專項支持(2009zx09501-026);國家自然科學(xué)基金面上項目(30771189)。

黃馨(1979-)，博士生，研究方向:分子細胞生物學(xué)。

鞠振宇，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向:分子細胞生物學(xué)。E-mail:zhenyuju@hotmail.com