長(zhǎng)春新堿對(duì)糖尿病兔腎小管間質(zhì)損傷的影響

劉偉林，朱 昆

(長(zhǎng)春解放軍第208醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，腎內(nèi)科，長(zhǎng)春 130062)

長(zhǎng)春新堿對(duì)糖尿病兔腎小管間質(zhì)損傷的影響

劉偉林，朱 昆

(長(zhǎng)春解放軍第208醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，腎內(nèi)科，長(zhǎng)春 130062)

目的 觀察長(zhǎng)春新堿對(duì)糖尿病兔腎小管－間質(zhì)損傷的影響。方法 24只日本大白兔隨機(jī)分成正常對(duì)照組(control組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病長(zhǎng)春新堿治療組(DV組);耳緣靜脈注射四氧嘧啶造成糖尿病兔模型，DV組每周進(jìn)行一次長(zhǎng)春新堿耳緣靜脈注射;胰島素控制DM組、DV組血糖16.0～25.0mmol/L。8周時(shí)測(cè)各組兔血糖、腎重、體重、尿β2－MG、RBP、NAG，腎組織病理觀察腎小管－間質(zhì)變化。結(jié)果 給藥后7 h DV組、DM組血糖明顯升高形成穩(wěn)定糖尿病模型;8周時(shí)，DV組體重明顯高于DM組(P＜0.05)、腎重/體重值明顯低于DM組(P＜0.05);DM組、DV組尿β2－MG陽(yáng)性反應(yīng)率較低;DM組尿RBP、NAG明顯高于control組(P＜0.05)，長(zhǎng)春新堿可抑制糖尿病兔尿RBP、NAG增加(P＜0.05)，并減輕糖尿病兔腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(P＜0.05)。結(jié)論 長(zhǎng)春新堿可減輕糖尿病兔腎小管間質(zhì)損傷。

糖尿病;兔;炎癥;長(zhǎng)春新堿;腎小管－間質(zhì)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，進(jìn)入臨床階段后病程進(jìn)展很快，治療方法有限。既往的研究多集中在腎小球上，對(duì)腎小管間質(zhì)的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)觀察了糖尿病兔尿 β2－微球蛋白(β2－MG)、視黃醇結(jié)合蛋白(retinol－binding protein，RBP)、N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶(N－Acetyl－β－D－Glucosaminidase，NAG)變化及腎小管間質(zhì)病理?yè)p傷，初步探討了長(zhǎng)春新堿(vincristine，VCR)對(duì)這些變化的影響。

1 材料和方法

取24只雄性日本大白兔，空腹體重1.5～2.0 kg之間，隨機(jī)分成對(duì)照組(control組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病長(zhǎng)春新堿治療組(DV組)，三組之間體重、血糖無(wú)顯著差異;禁食水8 h后，將四氧嘧啶(Sigma公司)用生理鹽水配制成2.5%溶液，按0.1 g四氧嘧啶/kg于0.5 min內(nèi)耳緣靜脈注射入DM組、DV組兔體內(nèi)，control組注射生理鹽水，之后自由進(jìn)食水。至72 h，DM組、DV組兔血糖大于16.0mmol/L，造模成功;每周兩次給生物合成人胰島素注射液(丹麥諾和諾德公司)皮下注射，劑量2～4 u/kg，控制血糖16.0～25.0mmol/L;對(duì)照組皮下注射生理鹽水。

造模成功后，DV組予每周一次耳緣靜脈注射長(zhǎng)春新堿(上海華聯(lián)制藥有限公司)，劑量按成人每周1 mg/60kg由動(dòng)物給藥公式［1］換算;DM組和control組予生理鹽水耳緣靜脈注射。每周監(jiān)測(cè)各組血糖、體重變化;血糖用美國(guó)FreeStyle血糖分析儀檢測(cè)。

于第8周禁食水8 h后，稱(chēng)兔體重、測(cè)血糖，膀胱穿刺取尿液超低溫保存，氯胺酮麻醉后取腎臟稱(chēng)重;計(jì)算腎重/體重值。

沿縱軸切開(kāi)一側(cè)腎臟，置于10%中性甲醛固定，石蠟包埋，2 μm切片行PAS染色。高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇20個(gè)腎小管間質(zhì)視野(無(wú)腎小球和血管)，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)軟件(北京航空航天大學(xué))測(cè)定腎小管間質(zhì)面積。腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:正常為0分;損傷面積＜25%為1分;損傷面積25%～50%為2分;損傷面積＞50%為3分。腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(tubulointerstitial injury index，TII)為各視野積分平均值。

采用膠乳免疫比濁法檢測(cè)尿?2－MG(試劑盒購(gòu)自威特曼生物科技南京有限公司)、免疫透射比濁法檢測(cè)RBP(試劑盒購(gòu)自上海北加生化試劑有限公司)、速率法測(cè)定NAG(試劑盒購(gòu)自威特曼生物科技南京有限公司)，均按試劑盒說(shuō)明操作。

2 結(jié)果(圖1～3，見(jiàn)彩插Ⅳ)

8周時(shí)各組指標(biāo)變化(表1)。尿?2－MG在control組均呈陰性反應(yīng)，DV組2只兔呈陽(yáng)性反應(yīng)(2只均為0.03 mg/L)、DM組3只兔呈陽(yáng)性反應(yīng)(分別為 0.05 mg/L、0.29 mg/L、0.15 mg/L)。DM組腎組織可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞顆粒樣變性、空泡變性，管腔內(nèi)見(jiàn)蛋白管型，重者上皮細(xì)胞脫落，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化(圖1，2)，DV組腎小管間質(zhì)損傷明顯減輕(圖3)，兩組間TII比較差異顯著(P＜0.05)。

表1 8周時(shí)各組指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of the data among three groups at 8th week

3 討論

四氧嘧啶(alloxan)是一種β細(xì)胞毒劑，可選擇性損傷兔胰島細(xì)胞，引起化學(xué)性糖尿病。本實(shí)驗(yàn)中注射四氧嘧啶72 h后均導(dǎo)致兔持久性高血糖，體重增長(zhǎng)緩慢，形成穩(wěn)定的四氧嘧啶糖尿病模型。

典型的糖尿病腎病(DN)病理改變是腎小球基底膜增厚和系膜基質(zhì)增生導(dǎo)致的腎小球硬化癥，早期診斷可檢測(cè)尿微量白蛋白。糖尿病腎病也存在腎小管間質(zhì)損害，表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞肥大、顆粒樣和空泡樣變性，間質(zhì)水腫，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)，甚至腎小管病變先于腎小球病變［2］，本實(shí)驗(yàn)觀察到四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病兔同樣存在上述腎小管間質(zhì)損害。國(guó)內(nèi)有報(bào)道［3，4］通過(guò)檢測(cè) β2－MG、NAG等小管間質(zhì)損害指標(biāo)可早期診斷糖尿病腎病。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到8周糖尿病兔尿β2－MG檢出率較低，可能與β2－MG穩(wěn)定性差、在酸性尿中易分解有關(guān)，可見(jiàn)尿β2－MG檢測(cè)腎小管間質(zhì)損害靈敏性較低。尿NAG與RBP反映近端小管受損靈敏性相近，前者主要來(lái)自近端小管上皮細(xì)胞溶酶體，反映近端小管結(jié)構(gòu)的破壞，后者則反映近端小管重吸收功能減退，尚無(wú)觀察糖尿病患者尿RBP的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察到8周時(shí)糖尿病兔尿NAG、RBP均明顯高于正常對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)已出現(xiàn)腎小管結(jié)構(gòu)和功能受損。糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化程度與系膜增生、腎小球?yàn)V過(guò)率下降及蛋白尿程度呈正相關(guān)，是決定糖尿病腎病預(yù)后的重要指標(biāo)之一［5］。因此有必要將糖尿病腎小管間質(zhì)損害列為治療觀察指標(biāo)。

近期研究證實(shí)，高血糖、血液動(dòng)力學(xué)異常、血管緊張素Ⅱ增加均可加劇腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放炎癥趨化因子(如MCP－1)，刺激細(xì)胞外基質(zhì)分泌。已有學(xué)者證實(shí)抗炎治療可延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。Fujihara等［6］證實(shí)霉酚酸酯可延緩STZ致實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、腎小球高濾過(guò)和腎小球硬化。ACEI及ART1拮抗劑治療糖尿病腎病有效，部分是通過(guò)抗炎作用實(shí)現(xiàn)的［7］。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到長(zhǎng)春新堿對(duì)四氧嘧啶致實(shí)驗(yàn)性糖尿病兔發(fā)揮了作用，體重增長(zhǎng)較未治療組明顯，而尿NAG、RBP均明顯低于未治療組，腎臟病理顯示腎小管間質(zhì)損害明顯減輕。長(zhǎng)春新堿為細(xì)胞毒類(lèi)藥物，我們推測(cè)其具有抑制腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞增殖、限制炎癥趨化因子表達(dá)等抗炎作用，從而減輕腎小管結(jié)構(gòu)和功能受損。已證實(shí)腎病患者慢性炎癥狀態(tài)是營(yíng)養(yǎng)不良的重要原因，本研究DV組兔體重明顯高于DM組，可能與長(zhǎng)春新堿抗炎作用有關(guān)。

此外，糖尿病腎病存在細(xì)胞周期異常。腎小管上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞完成有限增生后發(fā)生肥大［8，9］，小管間質(zhì)成纖維細(xì)胞及腎小球內(nèi)皮細(xì)胞則持續(xù)增生［10，11］，增生肥大的細(xì)胞分泌更多的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，導(dǎo)致腎臟體積增大。長(zhǎng)春新堿作為細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用于M期，抑制細(xì)胞增生。本實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)春新堿治療組腎重/體重值明顯低于未治療的糖尿病兔腎重/體重值，可能與長(zhǎng)春新堿抑制腎臟細(xì)胞增生有關(guān)。

長(zhǎng)春新堿還可以改善血小板功能，抑制血小板凝集，緩解腎病的高凝狀態(tài)［12］，間接發(fā)揮抗炎、抗增生作用。

本實(shí)驗(yàn)觀察到長(zhǎng)春新堿可降低糖尿病兔腎重/體重值、尿NAG、RBP，減輕糖尿病兔腎小管間質(zhì)損害，其治療機(jī)制有待通過(guò)免疫組化、分子生物學(xué)等方法進(jìn)一步研究。

［1］孫敬方.藥物研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法［M］.見(jiàn):孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:356－378.

［2］李丹清，王穎，周桂玲，等.糖尿病腎病大鼠腎小管與腎小球病變的順序及其意義［J］.中華糖尿病雜志，2004，12(3):219－224.

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Impact of Vincristine on Tubulointerstitial Injury of the Rabbit Model with Diabetes Mellitus

LIU Wei－lin，ZHU Kun
(The 208 Hospital of People Liberation Army，Changchun 130062，China)

Objective To investigate the impact of vincristine by tubulointerstitial injury to the rabbit model with diabetes mellitus.Method Male Japanese white rabbits were divided into three groups:control group，diabetes mellitus group(DM group)，diabetes mellitus treated with vincristine group(DV group).Alloxan was intravenously injected to make rabbit model with diabetes mellitus.Rabbits of DV group were intravenous－injected with vincristine.Blood glucouse of DM group and DV group fluctuates between 16.0～25.0mmol/L via insulin treatment.At the end of 8 weeks all rabbits were killed to determine blood glucouse value(BG)，kidney weight/body weight ratio(KW/BW)，urineβ2－microglobulin(β2－MG)，retinol－binding protein(RBP)，N－Acetyl－β－D－Glucosaminidase(NAG)concentration，tubulointerstitial injury were observed by light microscopy.Results After 72 hours of injecting vincristine，the models of DM group were established.At the end of 8 weeks，body weight in DV group was higher than that of DM group(P ＜0.05)，but KW/BW was lower than that of DM group(P ＜0.05).RBP，NAG concentration in DV group were significantly lower than that of DM group(P ＜0.05).Increased tubulointerstitial injury index in DM rabbits was lowered by vincristine(P＜0.05).Conclusion Vincristine could alleviate tubulointerstitial injury of the rabbit model with diabetes mellitus.

Diabetes mellitus;Rabbit;Inflammation;Vincristine;Tubulointerstitial

R587.1

A

1671－7856(2010)10－0052－03

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.014

2010－06－22

圖1 對(duì)照組
Fig.1 Control group

圖2 DM組
Fig.2 DM group

圖3 DV組
Fig.3 DV group

朱昆。E－mail:zhoogoo@sina.com