大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法的改良及其機(jī)制

余琛琳，蔡麗萍，徐 晨，劉志學(xué)，崔淑芳

(第二軍醫(yī)大學(xué)訓(xùn)練部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，上海 200433)

大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法的改良及其機(jī)制

余琛琳，蔡麗萍，徐 晨，劉志學(xué)，崔淑芳

(第二軍醫(yī)大學(xué)訓(xùn)練部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，上海 200433)

目的 改良大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法，比較改良前后兩種方法各自的特點(diǎn)及其機(jī)制。方法 60只體重(180±10)g的雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(C)、半乳糖性白內(nèi)障組1(G1)和半乳糖性白內(nèi)障組2(G2)。G1組腹腔注射50%半乳糖溶液20mL/(kg·d)，連續(xù)30 d;G2組第1周、第2周分別腹腔注射50%半乳糖溶液10、15mL/(kg·d)，第3周開始增至20mL/(kg·d)，直至第30d。應(yīng)用裂隙燈觀察晶體混濁情況，按大鼠晶狀體混濁度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)和記錄，并分別觀察和比較不同制備方法的成模時(shí)間、模型成功率、模型死亡率和晶狀體宏觀形態(tài)變化以及SOD、MDA含量的變化。結(jié)果 G1和G2組模型死亡率分別為50%和10%，方法改良后死亡率顯著降低;模型成功率分別為50%和90%，方法改良后成功率顯著提高;兩組模型晶狀體混濁度一般為Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí);與C組比較，G1和G2組SOD、MDA含量的變化均有極顯著差異(P＜0.01)，而G2與G1組比較，差異不顯著。結(jié)論 半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法改良后，保留了改良前模型制備方法的優(yōu)點(diǎn)，克服了改良前模型成活率低、死亡率高的缺點(diǎn)，是一種更為安全、可靠的模型制備方法。

半乳糖性白內(nèi)障;大鼠;模型，動(dòng)物

白內(nèi)障是世界上首位致盲眼病［1］，它不僅嚴(yán)重影響人們的視力和健康，給生活帶來(lái)諸多不便，而且造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。建立相應(yīng)的白內(nèi)障動(dòng)物模型是研究白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制、探索和評(píng)價(jià)治療白內(nèi)障藥物療效的必要手段。半乳糖性白內(nèi)障是較為常用的一種模型制備方法，但是該法制備過程中動(dòng)物存活率較低、模型死亡率較高一直是困擾研究人員的一個(gè)問題。為此，本文在以往研究的基礎(chǔ)上，對(duì)大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型的制備方法進(jìn)行改良，并系統(tǒng)觀察和比較造模方法改良前后的模型死亡率、模型成功率、成模時(shí)間、晶狀體宏觀形態(tài)變化以及SOD、MDA含量的變化情況，探討改良方法在人類白內(nèi)障研究中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性成年SD大鼠60只，體重180±10 g，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK(滬)2007－0003］，均飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室內(nèi)［SYXK(滬)2007－0003］。

1.1.2 試劑:D－半乳糖購(gòu)自上海藍(lán)季發(fā)展有限公司;生理鹽水購(gòu)自江蘇通用藥業(yè)有限公司。D－半乳糖與生理鹽水配成50%D－半乳糖－生理鹽水溶液，使用前配制，常規(guī)滅菌后使用。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase， SOD)、丙 二 醛 (malondialdehyde，MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器設(shè)備:裂隙燈顯微鏡(瑞安市博覽光學(xué)儀器廠);紫外/可見分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman);高速冷凍離心機(jī)(上海離心機(jī)廠)、超凈工作臺(tái)、手術(shù)顯微鏡、微量電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:60只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(C)、半乳糖性白內(nèi)障組1(G1)和半乳糖性白內(nèi)障組2(G2)(n=20)。1%阿托品擴(kuò)瞳后，經(jīng)裂隙燈顯微鏡檢查各組大鼠晶狀體均透明。

1.2.2 大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備:G1組大鼠每天腹腔注射50%D－半乳糖－生理鹽水溶液20mL/kg［相當(dāng)于 D－半乳糖 10 g/(kg·d)］，每天 1次，并自腹腔注射第10天開始同時(shí)給予含5%D－半乳糖飲用水飲用，共30 d;G2組大鼠第1周、第2周分別腹腔注射半乳糖溶液10、15mL/kg，第3周開始增至20mL/kg，直至第30天，每天1次，自腹腔注射第10天開始同時(shí)給予含5%D－半乳糖飲用水飲用，共30 d。

1.2.3 大鼠晶狀體檢查與混濁度分級(jí):自大鼠注射半乳糖溶液開始，每天1%阿托品擴(kuò)瞳，用裂隙燈顯微鏡對(duì)晶狀體逐一觀察、記錄，同步拍攝正、側(cè)位立體照片，晶狀體混濁度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表1)［3，4］。同時(shí)，觀察統(tǒng)計(jì)模型制作方法改良前后的模型死亡率、模型成功率和成模時(shí)間等。

1.2.4 大鼠晶狀體SOD活力與MDA含量測(cè)定:所有存活大鼠在注射第30天后，安樂死處理并立即取出雙側(cè)眼球，用0℃ ～4℃生理鹽水沖洗3次，剝離晶體，并用濾紙吸干，放在電子天平上稱質(zhì)量，將雙側(cè)晶體放入玻璃勻漿器內(nèi)，按質(zhì)量體積比1:9加入4℃磷酸鹽緩沖液，將勻漿器管底部浸入冰水混合物中充分研磨，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的晶體勻漿。將勻漿低溫離心10 min(3000 r/min)，取出上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定SOD活力和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件采用t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法改良前后，模型死亡率、模型成功率、成模時(shí)間的比較

G1組中20只大鼠，在第1天腹腔注射50%D－半乳糖－生理鹽水溶液20mL/(kg·d)后，第3天內(nèi)7只大鼠死亡，一周后共9只大鼠死亡，至裂隙燈顯微鏡對(duì)晶狀體觀察結(jié)束后，共10只大鼠死亡，模型死亡率高達(dá)50%;10只成活大鼠的晶狀體從注射后第9天開始均出現(xiàn)不同程度的混濁，模型成功率為50%(表2)。

G2組中20只大鼠，在第1周和第2周腹腔注射50%D－半乳糖－生理鹽水溶液后，出現(xiàn)1只大鼠死亡，第3周注射50%D－半乳糖－生理鹽水溶液20mL/(kg·d)后，1只大鼠死亡，至裂隙燈顯微鏡對(duì)晶狀體觀察結(jié)束后，未再出現(xiàn)大鼠死亡，模型死亡率為10%;18只成活大鼠中從注射后第11天開始有8只大鼠的晶狀體出現(xiàn)不同程度的混濁，第14天晶狀體均出現(xiàn)不同程度的混濁，大鼠模型成功率為90%(表2)。C組大鼠晶狀體沒有變化。

改良前后兩種造模方法的成模時(shí)間無(wú)顯著變化，分別為9 d和11 d;模型死亡率分別為50%和10%，改良后死亡率顯著降低(表2);模型成功率分別為50%和90%，改良后成功率顯著提高(表2)。

表1 大鼠晶狀體混濁度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The standard of score for severity of lens opacity in rats

表2 G1和G2組模型死亡率、模型成功率、成模時(shí)間的比較Tab.2 Comparison of the mortality，success rate and time of animal models between G1 and G2 group

2.2 大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法改良前后，模型的晶狀體混濁情況

G1和G2組大鼠腹腔注射50%D－半乳糖－生理鹽水溶液期間，持續(xù)裂隙燈顯微鏡觀察。兩組大鼠分別于注射第9天和第11天開始晶狀體陸續(xù)出現(xiàn)不同程度混濁，病程初期出現(xiàn)空泡，之后空泡液化或出現(xiàn)乳光，繼而出現(xiàn)點(diǎn)狀、條狀、楔狀甚至片狀沉淀(圖1、2)。觀察至第30天，所有存活大鼠中，G1組晶狀體Ⅱ級(jí)混濁(圖1)比例為40%、Ⅲ級(jí)混濁(圖2)比例為60%;G2組晶狀體Ⅱ級(jí)混濁(圖1)比例為55.6%、Ⅲ級(jí)混濁(圖2)比例為44.4%(表3)。(圖1～2，見彩插Ⅳ)

2.3 大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法改良前后，模型晶狀體SOD與MDA含量的比較

與對(duì)照組大鼠相比較，G1組和G2組大鼠SOD活力均降低、MDA含量均升高，且均有極顯著差異(P＜0.01)，表明兩組大鼠造模成功。而G2組與G1組相比較，SOD活力和MDA含量統(tǒng)計(jì)差異不顯著(P＞0.05)，表明兩組大鼠造模效果相當(dāng)(表4)。

表3 C、G1和G2組大鼠晶狀體混濁程度情況比較(例數(shù)，%)Tab.3 Comparison of lens opacities between C，G1 and G2 group(samples，%)

表4 C、G1和G2組晶狀體SOD和MDA含量的比較Tab.4 Comparison of the contents of SOD and MDA in lens between C，G1 and G2 group

3 討論

3.1 大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法的改良

應(yīng)用D－半乳糖誘發(fā)復(fù)制大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型，是目前制備白內(nèi)障動(dòng)物模型中較為常用的造模方法之一。多年來(lái)人們已對(duì)此造模方法作了不少改進(jìn)，但是腹腔注射D－半乳糖而導(dǎo)致的模型死亡率一直居高不下，注射的劑量也一直未得到很好的解決［5，6］。本研究中應(yīng)用兩種不同的方法制備大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型，改良前動(dòng)物的死亡率高達(dá)50%，模型成功率為50%。造成動(dòng)物死亡的原因可能是:腹腔注射20mL/kg劑量的D－半乳糖濃度過高，腹膜吸收半乳糖較快，整個(gè)腹腔臟器和組織處于高滲環(huán)境中，使組織細(xì)胞處于高滲狀態(tài)，容易使細(xì)胞脫水、脫鈉，數(shù)天內(nèi)就引起組織細(xì)胞功能異常甚至機(jī)體功能障礙從而導(dǎo)致動(dòng)物大量死亡。因而，本研究改良方法，從半乳糖溶液的注射劑量上進(jìn)行調(diào)整和控制，在造模第1周，腹腔注射半乳糖溶液的劑量為10mL/kg，相當(dāng)于全劑量的一半，第2周腹腔注射15mL/kg，相當(dāng)于全劑量的3/4，讓動(dòng)物對(duì)半乳糖試劑有個(gè)逐漸適應(yīng)的過程，減輕了高劑量半乳糖溶液對(duì)動(dòng)物的影響，有效的降低動(dòng)物的死亡率。第3周開始全劑量注射。方法改良后，模型死亡率降至10%，模型成功率為90%，且動(dòng)物晶狀體出現(xiàn)混濁現(xiàn)象的時(shí)間與改良前相當(dāng)。因此，方法改良后，實(shí)驗(yàn)操作依舊簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)耗費(fèi)減少了，特別是降低了模型死亡率，提高了動(dòng)物的成活率和模型成功率，是一個(gè)安全有效的白內(nèi)障動(dòng)物模型制備方法。

3.2 大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型的晶狀體宏觀形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)

D－半乳糖誘發(fā)的大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型與半乳糖代謝異常有關(guān)，尿苷轉(zhuǎn)移酶或半乳糖激酶缺乏，阻礙半乳糖衍生物向葡萄糖衍生物正常轉(zhuǎn)化，同時(shí)在醛糖還原酶催化作用下，通過旁路代謝形成甜醇。甜醇不能透過晶狀體囊膜，在晶狀體內(nèi)大量積聚，使晶狀體內(nèi)滲透壓增加、吸收水分，引起晶狀體纖維滲透性腫脹、崩解及壞死［7－9］，從而導(dǎo)致晶狀體水化、混濁，出現(xiàn)空泡、空泡液化、繼而出現(xiàn)點(diǎn)狀、條狀、楔狀甚至片狀沉淀。此病理過程進(jìn)程緩慢，大鼠歷時(shí)約1個(gè)月左右，與糖尿病性白內(nèi)障極為相似［10］，與年齡相關(guān)性白內(nèi)障也相似，其主要改變是晶狀體皮質(zhì)水電解質(zhì)平衡失調(diào)而導(dǎo)致晶狀體內(nèi)水分積聚引起的晶狀體纖維水腫、液化等病理變化。同時(shí)，本研究中改良后的D－半乳糖－生理鹽水溶液誘發(fā)的大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型的成模率高達(dá)90%，具有很好的重復(fù)性，可以大批量進(jìn)行模型的制備研究。因此，大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型適宜進(jìn)行人類半乳糖性、糖尿病性或者與皮質(zhì)性年齡相關(guān)性白內(nèi)障的機(jī)制和藥物等研究。

3.3 大鼠半乳糖性白內(nèi)障動(dòng)物模型晶狀體的成模機(jī)制

許多研究表明，氧化性損傷是誘發(fā)白內(nèi)障發(fā)生的主要因素［11］。半乳糖性白內(nèi)障發(fā)生過程中，高半乳糖血癥引起細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生減少，晶體抗氧化酶活性下降，晶體內(nèi)自由基增加，使晶體蛋白變性、混濁，導(dǎo)致白內(nèi)障。SOD是晶狀體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，在清除自由基、減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、保護(hù)晶狀體的氧化損傷方面發(fā)揮著極其重要的作用［12－14］。本研究中，兩組大鼠白內(nèi)障模型動(dòng)物的晶狀體SOD活力降低，同時(shí)MDA含量升高，符合成模機(jī)制。與空白對(duì)照組相比較，兩組模型大鼠SOD和MDA含量的變化均有顯著差異，但是兩組模型大鼠之間的比較差異不顯著，表明制備方法改良前后的成模效果相當(dāng)，改良后的方法保留了改良前模型制備方法的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還克服了改良前模型成活率低、死亡率高的缺點(diǎn)，是一種更為安全、可靠的模型制備方法。

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Improvement of Method of Establishing Rat's Galactose Cataract and Its Mechanism

YU Chen－lin，CAI Li－ping，XU Chen，LIU Zhi－xue，CUI Shu－fang
(Laboratory Animal Center，Training Department，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Objective To improve the method of establishing rat＇s galactose cataract and to compare the characteristics and its mechanism of the two methods.Methods 60 adult male SD rats weighted(180±10)g were randomly divided into normal control group(C group)，the first galactose cataract group(G1 group)and the second galactose cataract group(G2 group).Rats in G1 group were intraperitoneally injected with a single dose of 50%galactose solution［20mL/(kg·d)］each day for 30 d.Rats in G2 group were intraperitoneally injected with a single dose of 50%galactose solution［10mL/(kg·d)］each day during the first week，and 15mL/(kg·d)each day during the second week，and 20mL/(kg·d)from the third week to 30 d.The transparency of all lenses of rats was observed under slit lamp and graded and recorded according to rat lens turbidity score standards.The changes of the success rate，mortality，the transparency of all lenses，the contents of SOD and MDA were compared between G1 and G2 group.Results Compared to G1 group，the mortality in rat models of G2 group was significantly decreased from 50%to 10%，the success rate of it wassignificantly increased from 50%to 90%.The lenses of G1 and G2 group were in theⅡ－Ⅲ stage of cataract.Compared to C group，the contents of SOD of G1 and G2 group were significantly increased，and the contents of MDA of them were significantly decreased(P＜0.01).There were no significant difference of it between G1 and G2 group.Conclusion The method of establishing rat＇s galactose cataract of G2 group was a secure and reliable method，which remained the advantages of the method of G1 group and overcome the shortcomings of it with low survival rate and high mortality.

Galactose cataract;Rat;Model，animal

R－332

A

1671－7856(2010)10－0023－05

10.3969/j.issn.1671.7856.2010.10.007

2010－06－21

圖1 半乳糖性白內(nèi)障晶狀體Ⅱ級(jí)混濁
Fig.1 Lens opacity in Ⅱphase of galactose cataract

圖2 半乳糖性白內(nèi)障晶狀體Ⅲ級(jí)混濁
Fig.2 Lens opacity in Ⅲphase of galactose cataract

上海市科技發(fā)展基金項(xiàng)目(No.071409010)。

余琛琳(1981－)，女，講師，主要研究方向:人類疾病動(dòng)物模型。E－mail:ycl0408@163.com

崔淑芳(1969－)，女，教授，主要研究方向:人類疾病動(dòng)物模型。