高效液相色譜法測(cè)定忍冬藤不同采收期中綠原酸和咖啡酸的含量

李江

(江蘇省徐州市中醫(yī)院，江蘇徐州 221003）

忍冬藤為忍冬科植物忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）的干燥莖枝，具有清熱解毒，疏風(fēng)通絡(luò)的功效，用于溫病發(fā)熱，熱毒血痢等癥狀[1]。 現(xiàn)代化學(xué)、藥理研究表明，忍冬藤中的主要活性成分為有機(jī)酸類。由于綠原酸具有一定的抗菌抗感染作用[2-4]，而且在忍冬藤中含量較高，為其主要活性成分之一，因此，對(duì)忍冬藤的質(zhì)量控制研究仍主要以綠原酸的含量為指標(biāo)[5-8]。但是，至今尚未見到忍冬藤中有關(guān)采收期的研究報(bào)道。本文基于中藥中多成分、多靶點(diǎn)協(xié)調(diào)作用的特點(diǎn)，建立了HPLC-UV分析方法，同時(shí)對(duì)忍冬藤中綠原酸和咖啡酸進(jìn)行分析測(cè)定，并應(yīng)用該方法對(duì)忍冬藤的不同采收期樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，為忍冬藤的采收期及質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)為Aglient 1100 HPLC system，包括在線脫氣四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，柱溫箱，色譜柱為UltimateTMXB-C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）；JP300 型超聲波提取器（武漢嘉鵬電子有限公司）；十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒電子天平）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品和咖啡酸均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。實(shí)驗(yàn)用水（農(nóng)夫山泉礦泉水），甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為分析純。忍冬藤不同采收期樣品由我院制劑中心植物園采集，經(jīng)鑒定為忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥藤莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相：A相為0.3%甲酸，B相為乙腈，流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm，柱溫：25℃，洗脫條件：12∶88（甲酸水-乙腈）。理論塔板數(shù)按綠原酸計(jì)算，應(yīng)不低于2 000。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取忍冬藤藥材粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，加25 ml 50%甲醇（v/v），超聲提取30 min，再用50%甲醇補(bǔ)重，藥液過微孔濾膜（0.45 μm），進(jìn)樣 10 μl，進(jìn)行測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取各對(duì)照品適量，置于5 ml量瓶，甲醇溶解，定容，配制成1 mg/ml的混和標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密吸取混和標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，按上述色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，以峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品實(shí)際進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算。 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=2 241.5X＋9.8（r=0.999 6）， 線性范圍為2.5～125.0 μg/ml。 咖啡酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=3 635.3X-7.5（r=0.999 5）， 線性范圍為 1.2～60.0 μg/ml。 結(jié)果表明，2 種成分在檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量為10 μl，記錄峰面積，計(jì)算含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD小于2.0%，結(jié)果表明日內(nèi)精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一采收期的5份相同的忍冬藤樣品粉末，按照樣品測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的峰面積，計(jì)算出藥材中各成分含量，其RSD小于2.5%，重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取忍冬藤藥材粉末1.0 g，按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，每3小時(shí)測(cè)定1次，共測(cè)5次，計(jì)算峰面積的RSD，RSD小于3.0%，表明樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取0.50 g的5份已知含量的忍冬藤藥材粉末，分別加入對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試液并分析，加樣回收率在 96.0%～104.6%，RSD 小于 4.0%。

2.8 樣品含量測(cè)定

按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，進(jìn)樣 10 μl，計(jì)算含量，色譜圖見圖1，結(jié)果見表1。

表1 忍冬藤含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.1 Results of content determination of Caulis lonicerae(n=3)

3 討論

3.1 提取方法及溶液穩(wěn)定性的考察

筆者考察了超聲提取、回流提取、索式提取三種提取方法，含量測(cè)定結(jié)果相當(dāng)，超聲提取時(shí)間短，故采用超聲提取法制備樣品。酚酸類溶液隨著時(shí)間的放置，會(huì)變得不穩(wěn)定，但放在棕色瓶中，在24 h內(nèi)基本是穩(wěn)定。

3.2 含量測(cè)定結(jié)果

從表1的含量測(cè)定結(jié)果來看，忍冬藤的不同采收期內(nèi)，綠原酸的含量普遍高于咖啡酸的含量。比較不同的采收期可以發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)期藥材中化合物的含量存在很大的差異。如在九月至十二月的采收期內(nèi)，十月采收的樣品含量較高，十二月采收的較低。故選擇不同的采收時(shí)間，對(duì)忍冬藤的質(zhì)量控制至關(guān)重要。

本文建立和測(cè)定了忍冬藤不同采收期中酚酸類活性成分含量的HPLC方法，該測(cè)定方法的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性均較好，并利用建立的分析方法成功的測(cè)定了忍冬藤不同采收期藥材的含量，說明該方法可以用于忍冬藤的質(zhì)量控制。

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